作物遺傳育種研究進展Ⅳ.雙單倍體育種與反向育種

劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128)

雜交是重要的育種手段。雜交的基礎(chǔ)是基因重組?；蛑亟M的基礎(chǔ)是減數(shù)分裂時同源染色體的配對、形成交叉和姊妹染色單體的交換。一次減數(shù)分裂可實現(xiàn)的遺傳重組程度取決于2個因素:(1)染色體數(shù)目(染色體自由組合);(2)同源染色體發(fā)生交換的數(shù)目和位置(交換重組)。染色體的交換和重組并不是隨機發(fā)生的，有些區(qū)段易發(fā)生重組(熱區(qū))，有些不易發(fā)生重組(冷區(qū))。影響交換發(fā)生頻率和位置的因素包括內(nèi)在的基因型、性別和外在的溫度、化學(xué)處理等因素［1］。

交換和重組由基因控制，著名的例子是小麥能阻止減數(shù)分裂前著絲點聯(lián)會的Ph1基因?，F(xiàn)在控制交換和重組的許多基因已經(jīng)分離和克隆，如水稻中已經(jīng)分離出28個減數(shù)分裂相關(guān)基因［2］。這些基因突變或表達改變(如超表達、沉默)都可能導(dǎo)致重組頻率改變［3，4］。因而育種上可調(diào)控交換重組的發(fā)生頻率，利用交換重組的差異開發(fā)新的育種方法。

1 雙單倍體育種新方法

減數(shù)分裂的結(jié)果是產(chǎn)生配子，配子是具有單倍體染色體數(shù)目的細胞。由這種細胞發(fā)育成的植株是單倍體。單倍體染色體加倍后成為雙單倍體。雙單倍體具有純合速度快、用于選擇的群體小和隱性基因也能表達的優(yōu)點，因而在育種上有重要應(yīng)用價值。育種應(yīng)用的關(guān)鍵是如何獲得大量的單倍體植株。自從花藥培養(yǎng)取得成功后，利用花藥、小孢子或胚珠(未授粉子房)培養(yǎng)再生單倍體的方法被廣泛采用，并取得顯著效果［5～7］。但由花藥、小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體需要離體培養(yǎng)設(shè)施、應(yīng)用于育種存在基因型依賴性、分離扭曲、白化苗和體細胞變異等問題，更簡便的單倍體誘導(dǎo)方法是育種家追求的目標。

1.1 球莖大麥技術(shù)

Kao和Kasha(1970)發(fā)現(xiàn)栽培大麥用球莖大麥花粉授粉，F(xiàn)1代中球莖大麥染色體選擇性自動消失，出現(xiàn)了高頻率的雙單倍體(15.5%)和單倍體(11.0%)，從而創(chuàng)建了球莖大麥技術(shù)。采用球莖大麥技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的步驟如下:(1)種植做母本的栽培大麥材料(如F1)，必要時進行春化處理;(2)將花粉親本球莖大麥進行春化處理，以保證與栽培大麥材料花期同步;(3)栽培大麥去雄，當(dāng)2～3 d后開花時用球莖大麥花粉適時授粉，保持溫度高于18℃;(4)授粉1 d后用“75∶2∶1”(GA375 mg/L+2，4－D 2 mg/L+麥草畏(dicamba)1 mg/L)加Tween20TM12滴/L噴施到授粉后的小花上。如有必要噴施殺蟲劑。用褐紙袋代替硫酸紙袋給麥穗套袋;(5)當(dāng)胚長達1.5 mm時，剝?nèi)》N子用次氯酸鈉稀釋液進行種子表面滅菌;(6)在無菌條件下分離出胚，然后將充分發(fā)育的胚轉(zhuǎn)移到不含2，4－D的B5培養(yǎng)基上，并使盾片面朝下;(7)首先進行暗培養(yǎng)，直至苗長1～2 cm時再轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)，20～25℃都是適宜的培養(yǎng)溫度;(8)當(dāng)主分蘗達到50 mm長時，將小植株移栽到盆缽中，置于溫室;(9)形成了3個分蘗時用秋水仙堿(0.05%)和DMSO(2%)溶液在30℃下處理5 h進行加倍，處理結(jié)束后用自來水沖洗;(10)重新盆栽加倍處理的植株，讓其返青，成熟時收獲雙單倍體種子［8］。

受球莖大麥技術(shù)的啟發(fā)，后來發(fā)現(xiàn)普通小麥與球莖大麥、玉米、Tripsacum dactyloides、Pennisetum glaucum、Coix lacryma － jobi、Imperata cylindrica、燕麥與玉米、小黑麥與Imperata cylindrica等植物屬間雜交、馬鈴薯與S.phureja種間雜交也能誘導(dǎo)染色體選擇性消除，從而誘導(dǎo)母本單倍體產(chǎn)生［9］。

1.2 玉米花粉授粉誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)

Niu等(2014)詳細評述了小麥利用玉米花粉授粉誘導(dǎo)單倍體的過程和影響因子，并建立玉米花粉雜交誘導(dǎo)小麥單倍體的途徑:(1)在小麥雜種F1種植前10～14 d種植甜玉米(如雜種品種Early Sunglow)，每隔5～7 d種植一批，共種植5～6批;(2)在種植第3批甜玉米時種植小麥雜種F1;(3)小麥抽穗時人工去雄;(4)去雄后2～3 d用新鮮的玉米花粉給去雄的小麥穗授粉;(5)授粉后24 h用2，4－D(213.05 mg/L，pH=10.36)溶液噴施授過粉的小麥穗;(6)2，4－D處理后14～16 d將麥穗切下，分離種子用于胚挽救;(7)用70%乙醇將種子滅菌1 min，然后用20%Clorox(商用消毒液)滅菌20 min，用無菌蒸餾水清洗3次;(8)在無菌條件下分離胚，將胚接種在附加了50 g/L蔗糖和8%瓊脂的MS基本培養(yǎng)基上，在室溫(20～24℃)暗中培養(yǎng)大約2周;(9)胚萌發(fā)后將幼嫩的小苗轉(zhuǎn)移到附加了30 g/L蔗糖和8 g/L瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基上，在20～24℃、16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)大約2周;(10)當(dāng)幼苗長至5～6 cm時移栽到盆缽中，在18～20℃、16 h/8 h光周期條件下生長，并施緩釋肥;(11)當(dāng)植株有2～3個分蘗時將植株從盆缽中挖出，根系徹底沖洗干凈，將根系和根莖浸于秋水仙堿溶液(秋水仙堿0.45 g/L+DMSO 20 mL/L+GA3100 mg/L+Tween80 0.3 mL/L，pH=5.5)中，20 ～22℃暗中加倍處理8 h。加倍時要給秋水仙堿溶液提供輕柔的氣流;(12)加倍處理后，用流水將植株沖洗過夜，然后栽回到盆缽中，并施緩釋肥;(13)將植株在14～16℃、16 h/8 h光周期生長室生長大約2周直至植株返青(長出新的分蘗)，再將植株搬到溫室(20～24℃、16 h/8 h 光周期)種植直至成熟［10］。

1.3 玉米單倍體誘導(dǎo)技術(shù)

玉米的單倍體誘導(dǎo)不是通過種屬間雜交，而是通過利用種內(nèi)特殊的基因型即誘導(dǎo)系雜交進行，不僅能誘導(dǎo)母本(雌配子)單倍體，而且能誘導(dǎo)父本(雄配子)單倍體。不管誘導(dǎo)哪種類型的單倍體，都需要培育高效的單倍體誘導(dǎo)系、利用遺傳標記高效鑒定單倍體和建立有效的染色體加倍技術(shù)。

玉米母本單倍體誘導(dǎo)最先使用的誘導(dǎo)系是Stock 6，后來培育出單倍體誘導(dǎo)率達10%的誘導(dǎo)系RWS及其姊妹系RWK－76。用這些誘導(dǎo)系在雜交時作父本，與擬誘導(dǎo)單倍體的玉米材料(如F2代植株)雜交所結(jié)的籽粒只有很少部分具有單倍體胚和三倍體胚乳，而大多數(shù)是正常的二倍體胚和三倍體胚乳。廣泛利用的遺傳標記是R1－nj基因，它與A1、A2、C1和C2同時存在于誘導(dǎo)系時使得正常籽粒胚和胚乳均呈深紫色，而具有單倍體胚的籽粒胚乳呈紫色，但胚無色。選留的具有單倍體胚的籽粒萌發(fā)后用0.06%的秋水仙堿處理進行染色體加倍。加倍后選擇雄性可育植株自交獲得雙單倍體株系［11，12］。值得指出的是，這種方式獲得的母本單倍體可能導(dǎo)入了誘導(dǎo)系的染色體片段［13］。

玉米父本單倍體誘導(dǎo)用具有ig1(位于3號染色體)和R1－nj純合基因型誘導(dǎo)系作母本，與擬誘導(dǎo)單倍體的玉米材料(通常是r1/r1純合體)進行雜交，對所結(jié)的籽粒按照前述方法根據(jù)胚有無顏色進行選擇，選留無色胚作為雄配子單倍體，進行染色體加倍和自交處理［11］。

利用染色體易位系將ig1和R1－nj基因?qū)氲讲挥毎|(zhì)中，培育細胞質(zhì)雄性不育(CMS)ig1和R1－nj純合基因型誘導(dǎo)系，利用這種具有不育細胞質(zhì)的誘導(dǎo)系作母本，與擬誘導(dǎo)單倍體的玉米自交系(幾乎全是r1/r1純合體)進行雜交，通過選留無色胚的籽粒種植，只要鑒定出一株或幾株雄配子單倍體植株，并用原來的優(yōu)良自交系回交，就能將優(yōu)良自交系轉(zhuǎn)育成二倍體CMS系，所以轉(zhuǎn)育CMS系只需2個世代，單倍體不需要加倍，而且育成的CMS系基因組與自交系完全相同［11］。

1.4 染色體選擇性消除機制和著絲粒介導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)

上述通過雜交誘導(dǎo)單倍體的技術(shù)，親本之一的染色體在授粉后幾天(如玉米母本單倍體誘導(dǎo)在授粉后7 d、球莖大麥技術(shù)在授粉后5～9 d)內(nèi)就選擇性消失。為什么會發(fā)生這種染色體選擇性消失目前尚不完全清楚［13］。Sanei等［14］研究發(fā)現(xiàn)，栽培大麥用球莖大麥花粉授粉后球莖大麥染色體分裂異常，落后于栽培大麥染色體，1周內(nèi)完全消失，是因為這些落后的染色體沒有CENH3(著絲粒特有的組蛋白H3變型)蛋白質(zhì)，導(dǎo)致球莖大麥染色體著絲粒鈍化，因而認為著絲粒CENH3蛋白質(zhì)的喪失與染色體選擇性消除有關(guān)，并提出了染色體選擇性消除的機制(圖1)，即栽培大麥用球莖大麥花粉授粉后，在合子中雙親的CENH3基因均轉(zhuǎn)錄，并且栽培大麥的CENH3基因轉(zhuǎn)錄后還翻譯為蛋白質(zhì)，在細胞分裂周期的G2期上載到栽培大麥染色體的著絲粒，但不上載到球莖大麥染色體的著絲粒，導(dǎo)致球莖大麥的染色體由于著絲粒鈍化在有絲分裂后期落后，形成微核，最終被降解，發(fā)育成栽培大麥的單倍體胚。

圖1 球莖大麥授粉誘導(dǎo)栽培大麥單倍體的機制［14］

CENH3是著絲粒特有的蛋白質(zhì)。Ravi和Chan［15］將CENH3蛋白進行改造，保持其 C端組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域，但在其N端連接上綠色熒光蛋白(GFP)，并用H3.3變型替代H3變型，使CENH3變成了GFP－tailswap，具有GFP－tailswap基因型的植株育性低，尤其是雄性育性低。當(dāng)GFP－tailswap植株用野生型植株花粉授粉，后代中25% ～45%的植株是父本單倍體(細胞質(zhì)來自母本)，其余是二倍體或非整倍體。當(dāng)野生型植株用GFP－tailswap植株花粉授粉，后代中既有母本單倍體，也有非整倍體，但單倍體和非整倍體頻率低于野生型植株花粉授粉。單倍體植株無需加倍，能自交結(jié)實，獲得少量二倍體種子(擬南芥50～2 500粒種子)。由于每種作物都有CENH3蛋白質(zhì)，因此從理論上看，通過調(diào)控CENH3基因來誘導(dǎo)單倍體都有可能。實踐表明，用這種方法可以快速獲得大量單倍體［16］。

不同單倍體誘導(dǎo)方法的主要特點和廣泛應(yīng)用的作物如表1。

表1 不同單倍體誘導(dǎo)方法的主要特點和應(yīng)用作物

2 反向育種

雜交育種期望在減數(shù)分裂時通過促進同源染色體的交叉、交換，實現(xiàn)基因重組，打破有利基因與不利基因之間的遺傳重組，最終將有利基因聚集到一起。反向育種正好與此相反，期望完全阻止同源染色體的交叉、交換，使得同源染色體在減數(shù)分裂中期Ⅰ和后期Ⅰ如同單價體一樣隨機分離。如何阻止雜種F1減數(shù)分裂時同源染色體配對，Dirks等曾設(shè)想了多種途徑，如通過RNA干擾或病毒誘導(dǎo)的基因沉默敲除減數(shù)分裂過程中某些關(guān)鍵基因的表達或施用基因表達的抑制劑［17］。Wijnker等通過RNA干擾敲除DMC1(交換形成必需的減數(shù)分裂特異重組酶)基因，獲得的50株轉(zhuǎn)基因植株，從正常可育到幾乎不育的都有，不育植株在粗線期沒有觀察到染色體配對，只有單價體，染色體隨機分離，很少形成有活力的平衡配子和種子［18］。由于單價染色體隨機分離，形成有活力的平衡配子的比例取決于作物的單倍體染色體數(shù)目(x)，平衡配子的比例為1/2x，說明作物單倍體染色體數(shù)目越多，有活力的配子比率越低。另一個方面是配子的數(shù)目，如果減數(shù)分裂形成的配子數(shù)目多，即使有活力的配子比率低，也能獲得足夠有活力的平衡配子。理論分析認為如果作物單倍體染色體數(shù)目超過12，難以獲得足夠的平衡配子。關(guān)于平衡配子的利用，在反向育種中是通過誘導(dǎo)形成單倍體實現(xiàn)的。Wijnker等將DMC1基因RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株雜交獲得F1，然后用F1植株的花粉給GFP－tailswap植株授粉，誘導(dǎo)單倍體，這種單倍體中少數(shù)具有親本同樣的染色體組成，多數(shù)有1或幾條染色體被替換，由單倍體植株收獲自交種子，下一代就是可育的二倍體。具有5對染色體的擬南芥染色體隨機分離最多能形成32(25)種基因型，從65個誘導(dǎo)的單倍體中觀察到其中21種基因型，并包括了親本類型。這21種基因型中，有6對是互補的，這些互補的雙單倍體系遺傳組成不同，也不同于原親本，但雜交后可重建原親本配制的雜種［18］。因為雙單倍體系可自交繁殖，用互補的雙單倍體系雜交可重建原親本配制的雜種，因而能固定雜種基因型，從而固定雜種優(yōu)勢。一種作物通過反向育種能培育的雙單倍體(DH)系數(shù)目最多為2x個，2個DH系能形成互補的一對親本的概率為1/2x［2x/(2x)2］，不能互補的概率為(2x－1)/2x，如有n個DH系，假設(shè)正反交表型一樣，它們所能配制的組合數(shù)目為n(n－1)/2，這n個DH系中至少某2個 DH系能形成互補的概率為［(2x－1)/2x］n(n－1)/2。對于一個單倍體染色體數(shù)目為x的作物而言，要想通過反向育種找到1對互補DH系重建原始雜種，至少需要誘導(dǎo)的染色體非重組的DH系數(shù)目(n)見表2。

通過反向育種進行雜種重建包括以下步驟(圖2):(1)通過轉(zhuǎn)基因(如DMC1基因RNAi干擾)選育染色體不交叉、半不育的親本;(2)用野生型親本給半不育親本授粉，從半不育親本上收獲雜種F1種子;(3)用雜種F1植株的花粉給GFP－tailswap植株授粉，誘導(dǎo)單倍體形成，從GFP－tailswap植株上收獲種子;(4)種植從GFP－tailswap植株上收獲的種子，選留單倍體植株，單倍體植株自交后收獲自交種子，成為DH系;(5)選擇互補的染色體被替換的DH系進行雜交重建原始雜種，固定雜種優(yōu)勢。

表2 不同作物不同概率下重建原始雜種需要培育的染色體非重組的DH系數(shù)目(n)［17］

圖2 通過反向育種進行雜種重建的程序［19］

反向育種在固定雜種優(yōu)勢這一點上類似于無融合生殖，但優(yōu)于無融合生殖。因為反向育種不僅能固定雜種基因型，而且能通過對親本的改良而改良雜種，而無融合生殖不能改良雜種。

3 無性種子繁殖

無融合生殖能固定雜種優(yōu)勢，但在主要作物中沒有一種作物能進行無融合生殖。育種上期望將作物近緣植物的無融合生殖基因轉(zhuǎn)移到作物中，但是至今也未能取得成功［20］。無融合生殖是二倍體體細胞(如大孢子母細胞)不經(jīng)減數(shù)分裂直接發(fā)育為種子，能否模擬這一過程阻斷減數(shù)分裂?減數(shù)分裂有三個特點:(1)DNA只復(fù)制1次，但進行2次細胞分裂;(2)同源染色體配對，形成交叉，發(fā)生交換重組;(3)在第一次分裂時姊妹染色單體共分離?？刂仆慈旧w配對的基因SPO11、調(diào)控染色單體分離的基因REC8和控制進入第二次分裂的基因OSD1的三重突變體MiMe減數(shù)分裂的第一次分裂類似于有絲分裂，且不經(jīng)歷第二次分裂，因而形成不減數(shù)的雌、雄配子(2n配子)，自交產(chǎn)生四倍體，與野生型回交產(chǎn)生三倍體，說明所產(chǎn)生的配子是有功能的［21］。進一步的遺傳標記分析表明這種配子保持了母體植株的基因型，說明減數(shù)分裂已被有絲分裂所取代。

無融合生殖不僅沒有減數(shù)分裂，而且還需要卵細胞不依賴受精能發(fā)育為胚(孤雌生殖)和形成胚乳。MiMe三重突變體能形成有活力的配子，自交也能結(jié)實，但后代染色體不斷加倍，形成多倍體(四倍體、八倍體)，降低育性［21］。為了解決這一問題，將GFP－CENH3和GFP－tailswap導(dǎo)入到cenh3－1突變體，培育出共表達CENH3不同變型、能消除染色體組的GEM系，用GEM系給MiMe三重突變體授粉，能結(jié)種子(擬南芥平均每角果結(jié)14粒種子)，由于父本染色體消除，后代中34%為母本來源的二倍體;也可用MiMe的花粉給GEM系授粉，由于母本染色體的消除，后代中42%為父本來源的二倍體［22］，從而實現(xiàn)通過種子進行無性繁殖的目的。

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