mRNA電轉(zhuǎn)抗CD3抗體刺激的PBMC方法的建立

胡 愉，趙 慧,2，王 準(zhǔn)，何 維*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005； 2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室， 北京 100050)

研究論文

mRNA電轉(zhuǎn)抗CD3抗體刺激的PBMC方法的建立

胡 愉1，趙 慧1,2，王 準(zhǔn)1，何 維1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，
北京 100005； 2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室， 北京 100050)

目的建立信使RNA(mRNA)電轉(zhuǎn)抗CD3抗體刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的方法，為制備基因修飾CDR3δ移植型γδ T淋巴細(xì)胞，為腫瘤細(xì)胞過繼治療提供新的技術(shù)方法。方法以SpeⅠ內(nèi)切酶消化重組pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒，回收純化線性化的重組質(zhì)粒pGEM4Z/EGFP/A64，體外轉(zhuǎn)錄成mRNA；在電轉(zhuǎn)參數(shù)為500 V 500 μs、400 V 500 μs或300 V 500 μs等不同條件下，轉(zhuǎn)染抗CD3抗體刺激的人PBMC；用倒置熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀觀察和分析綠色熒光蛋白的表達(dá)；臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算不同電轉(zhuǎn)條件下細(xì)胞的存活率，以確定mRNA電轉(zhuǎn)最佳條件。結(jié)果pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒經(jīng)過SpeⅠ內(nèi)切酶酶切，獲得了線性化的質(zhì)粒；體外轉(zhuǎn)錄得到了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)mRNA； 與其他轉(zhuǎn)染條件相比，在500 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下轉(zhuǎn)染EGFPmRNA的PBMC細(xì)胞，電轉(zhuǎn)后48 h綠色熒光蛋白表達(dá)量較高；與其他轉(zhuǎn)染條件相比，在500 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下轉(zhuǎn)染EGFPmRNA的PBMC細(xì)胞，電轉(zhuǎn)48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞高達(dá)77%；臺(tái)盼藍(lán)染色分析不同電轉(zhuǎn)條件下細(xì)胞的存活率，在細(xì)胞電轉(zhuǎn)48 h后，500 V 500 μs參數(shù)電轉(zhuǎn)條件下細(xì)胞存活率可以達(dá)到85%以上。結(jié)論電轉(zhuǎn)參數(shù)為500 V 500 μs的條件可用于電轉(zhuǎn)mRNA于抗CD3抗體擴(kuò)增的人PBMC，以制備基因修飾T淋巴細(xì)胞。

信使RNA；電轉(zhuǎn)；外周血單個(gè)核細(xì)胞；加強(qiáng)型綠色熒光蛋白

γδT細(xì)胞獨(dú)特的抗原識(shí)別模式及其廣譜的腫瘤殺傷活性已使其成為深受人們關(guān)注的腫瘤過繼免疫治療的候選細(xì)胞。目前，用于腫瘤過繼免疫治療的γδT細(xì)胞主要是通過體外擴(kuò)增制備[1- 2]。但是，中晚期腫瘤患者或化療后患者體內(nèi)免疫抑制，導(dǎo)致γδT細(xì)胞數(shù)量減少和免疫活性下降，致使體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞數(shù)量受限，難以得到治療所需量的細(xì)胞制劑。利用基因修飾的方法獲得足夠數(shù)量的腫瘤反應(yīng)性γδ T細(xì)胞，用于腫瘤的γδT細(xì)胞特異性過繼治療，不失為獲取數(shù)量充足、安全且有良好生物學(xué)功能的γδT細(xì)胞制劑的可取途徑?；赗NA基因修飾淋巴細(xì)胞的過繼細(xì)胞免疫治療的研究已有報(bào)道[3- 4]。本研究擬以加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因?yàn)閷?duì)象，建立體外轉(zhuǎn)錄及電轉(zhuǎn)mRNA至抗CD3抗體擴(kuò)增的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的方法，以為新型基因工程γδTCR表達(dá)細(xì)胞制備提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌種

pGEM4Z/EGFP/A64是含EGFP基因序列的表達(dá)重組質(zhì)粒，用于體外轉(zhuǎn)錄mRNA(布魯塞爾自由大學(xué)Joeri L.Aerts教授惠贈(zèng))；大腸桿菌DH5α為本室保存，基因型為：supE44lacU169(80lacZM15)hsdR17recA1end1gyr96thi-1relA1, 用于質(zhì)粒的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)化。

1.2 試劑及試劑盒

Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和T4DNA連接酶(Fermentas公司)；Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制劑、dNTP、瓊脂糖和小量質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司)；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000(大連寶生物工程有限公司)；SpeⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、氨芐青霉素等均為國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純?cè)噭?；?xì)胞裂解液(Pierce公司)；淋巴細(xì)胞分離液(TBD公司)；RPMI-1640、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；抗CD3 抗體(UCHT1)(BD公司)；DNA片段純化試劑盒(Axygen公司)；The mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit(Ambion公司)；MinElute Reaction Cleanup 回收試劑盒和RNasey Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)。

1.3 pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

取制備好的感受態(tài)細(xì)胞100 μL大腸桿菌E.coliDH5，加入1 μL質(zhì)粒，混勻，冰上放置30 min，42 ℃熱休克90 s，迅速插入冰中，冰浴5 min。加入200 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min，振蕩培養(yǎng)1 h，鋪于含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)過夜至菌落直徑為1～2 mm。

1.4 質(zhì)粒的小量制備

按照Qiagen質(zhì)粒小量制備試劑盒說明書進(jìn)行。1.5 mL單菌落培養(yǎng)菌液，10 000×g離心20 s，棄上清。加5 μL RNase A和250 μL冰預(yù)冷的重懸液重懸細(xì)菌沉淀，劇烈振蕩；加入250 μL新配制的裂解液，顛倒混勻，冰浴5 min，再加入350 μL冰預(yù)冷的中和液，混勻后冰上放置10 min。室溫12 000×g，離心10 min，收集上清到回收柱中， 12 000×g，離心1 min，棄廢液。加入700 μL洗脫液洗2遍。收集洗脫液，室溫干燥后，溶解于30 μL去離子水中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 線性化的pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒制備

在0.5 mL離心管中加入質(zhì)粒DNA 2 μg、酶切緩沖液5 μL、100×牛血清白蛋白(BSA)0.5 μL、SpeⅠ內(nèi)切酶1 μL，補(bǔ)加去離子水至50 μL，混勻后37 ℃孵育3 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，DL2000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

按照MinElute Reaction Cleanup 回收試劑盒說明書操作回收線性化pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物加入300 μL溶液ERC，混勻，加于放入2 mL收集管中回收柱上，13 000×g離心1 min，棄離出液；加750 μL洗滌液PE，13 000×g離心1 min，棄離出液；將回收柱移入新的接收管上，加10 μL EB溶液，13 000×g離心1 min，收集含DNA片段的洗脫，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 體外轉(zhuǎn)錄及純化EGFP mRNA

按照Ambion公司體外轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行。取線性化重組質(zhì)粒DNA 1 μg，10×T7緩沖液2 μL, 2×NTP/CAP 10 μL, T7連接酶2 μL, 補(bǔ)加無RNA酶水至20 μL，將上述成分輕柔混合，簡短離心后37 ℃孵育3 h，加入1 μL DNase Ⅰ于37 ℃反應(yīng)15 min。

使用QIAGEN RNeasy Mini Kit，按照試劑盒操作說明純化體外轉(zhuǎn)錄的mRNA。即：加入溶液1，以調(diào)整樣品至100 μL，然后加入350 μL緩沖液RLT，混勻，加入250 μL無水乙醇，混勻。將上述樣本轉(zhuǎn)移到一個(gè)放置在2 mL的收集管上的RNeasy Mini 柱子，12 000×g離心1 min，棄離出液；加500 μL緩沖液RPE，12 000×g離心1 min，棄離出液；加500 μL緩沖液RPE，12 000×g離心2 min；將柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL 離心管上，加入50 μL去離子水，室溫靜置10 min后，12 000×g離心1 min；將柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL 離心管上，加入上一步洗脫出來的洗脫液(約45 μL)，室溫靜置10 min后，12 000×g離心1 min。收集洗脫液。測定260 nm的吸光度值(A260)，按照公式A260×稀釋倍數(shù)×40(μg/mL)計(jì)算RNA的量。分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗CD3單克隆抗體擴(kuò)增PBMC

RPMI-1640培養(yǎng)液1∶1稀釋的10%肝素抗凝正常人靜脈血，按常規(guī)法，用淋巴細(xì)胞分離液離心分離。吸取分離液界面乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/mL，備用。

500 μL內(nèi)含1 μg抗CD3單克隆抗體的RPMI-1640包被24孔板，37 ℃孵育2 h。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗3次, 將重懸好的PBMC加到洗滌好的24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，加入IL-2，終濃度為200 U/mL。37 ℃ 5% CO2環(huán)境培養(yǎng)，約3 d后備電轉(zhuǎn)用。

1.8 EGFP mRNA的轉(zhuǎn)染

離心收集細(xì)胞，用OPTI-MEM洗細(xì)胞1次。細(xì)胞重懸于OPTI-MEM至終濃度2.5×107/mL。冰上放置5 min。將RNA 10 μg和200 μL細(xì)胞移入電轉(zhuǎn)杯中并置入電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)參數(shù)為500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。電轉(zhuǎn)完畢后，立即移入含RPMI-1640完全培養(yǎng)基的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

在不同的時(shí)間收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFP的表達(dá)；臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算不同電轉(zhuǎn)條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活率。

2 結(jié)果

2.1pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒的線性化及酶切鑒定

將獲得的pGEM4Z/EGFP/A64質(zhì)粒經(jīng)過SpeⅠ內(nèi)切酶酶切，獲得了線性化的質(zhì)粒。電泳鑒定結(jié)果如圖1所示，第2泳道是環(huán)形質(zhì)粒，第3泳道是單酶切后的線性質(zhì)粒。

1,4.DNA markers of DL15000 and DL 2000, respectively; 2.circled plasmids; 3.plasmids linearized by Spe Ⅰ圖1 線性化pGEM4Z/EGFP/A64的鑒定Fig 1 Identification of linearized plasmid pGEM4Z/ EGFP/64A

2.2 體外轉(zhuǎn)錄EGFP mRNA

20 μL反應(yīng)體系，用1 μg線性化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄并經(jīng)RNeasy Mini 柱2次純化后，得到EGFPmRNA的量在12～20 μg之間；為此進(jìn)行了4個(gè)反應(yīng)，共獲得60 μgEGFPmRNA。

2.3 抗CD3抗體擴(kuò)增人PBMC的鑒定

人PBMC經(jīng)固相化抗CD3抗體擴(kuò)增后，流式細(xì)胞儀檢測，80%～87%為CD3+細(xì)胞(圖2)。

圖2 抗CD3抗體擴(kuò)增人PBMC的流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig 2 Flow cytometry analysis of PBMC amplified by anti-CD3 antibody

2.4 不同條件mRNA電轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率的鑒定

在500 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下轉(zhuǎn)染EGFPmRNA的細(xì)胞EGFP表達(dá)水平明顯高于在400 V 500 μs或300 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下轉(zhuǎn)染EGFPmRNA細(xì)胞EGFP表達(dá)量。而且在電轉(zhuǎn)48 h后的表達(dá)水平最高(圖3A)。在500 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下電轉(zhuǎn)染EGFP

mRNA 48 h后，表達(dá)EGFP的細(xì)胞比例達(dá)到77%(圖3B)，明顯高于在300 V 500 μs或400V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下電轉(zhuǎn)染EGFPmRNA 表達(dá)EGFP的細(xì)胞比例。

在所采用的各種電轉(zhuǎn)條件下，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率均在75%以上。雖然在細(xì)胞電轉(zhuǎn)24 h時(shí)間點(diǎn)，500 V 500 μs電轉(zhuǎn)參數(shù)下細(xì)胞的存活率較其他參數(shù)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞存活率略低，但是在細(xì)胞電轉(zhuǎn)48 h后，500 V 500 μs參數(shù)電轉(zhuǎn)條件下細(xì)胞存活率可以達(dá)到85%以上，3種電轉(zhuǎn)條件之間沒有明顯的差異(圖4)。

3 討論

γδT細(xì)胞因其識(shí)別抗原廣泛，且識(shí)別沒有主要組織性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)限制性，已成為腫瘤過繼免疫治療的候選細(xì)胞。目前，將γδT細(xì)胞用于臨床不外乎以下兩種策略[2,5]：一種是體內(nèi)應(yīng)用γδT細(xì)胞的刺激配體，使其在體內(nèi)擴(kuò)增或激活γδT細(xì)胞；另一種是分離γδT細(xì)胞，隨后在體外大規(guī)模擴(kuò)增，擴(kuò)增后的γδT細(xì)胞用于腫瘤患者的過繼免疫治療。但是，中晚期腫瘤患者或化療后患者體內(nèi)免疫抑制，導(dǎo)致患者可提供的細(xì)胞數(shù)量減少和免疫活性下降，致使體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞數(shù)量受限，難以得到治療所需量的細(xì)胞制劑。建立一種新的細(xì)胞制備技術(shù)勢在必行。

圖4 不同電轉(zhuǎn)條件下電轉(zhuǎn)細(xì)胞的存活率Fig 4 Comparison of the survival rates of PBMCs after EGFP mRNA electroporation under different conditions

mRNA電轉(zhuǎn)技術(shù)[6]是一種非病毒非DNA的基因轉(zhuǎn)移的方法，相對(duì)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有如下優(yōu)勢：首先，電轉(zhuǎn)的mRNA不同于DNA轉(zhuǎn)染，它只在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，能夠用于許多質(zhì)粒轉(zhuǎn)染難以表達(dá)的細(xì)胞如原代的T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾； 再者，穩(wěn)定的mRNA不含病毒啟動(dòng)子，不需要對(duì)細(xì)胞具有毒性的轉(zhuǎn)染試劑，不必清除細(xì)菌污染物，電轉(zhuǎn)的信使RNA較為安全；此外，mRNA電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞具有較高的存活率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地證明了這一優(yōu)勢。但是，mRNA的電轉(zhuǎn)條件與質(zhì)粒電轉(zhuǎn)條件相反，在低電壓的寬波下才能成功。最終成功獲得了mRNA電轉(zhuǎn)的優(yōu)化條件，電轉(zhuǎn)EGFPmRNA入原代PBMC，獲得了77%的高表達(dá)率，以及80%以上的細(xì)胞存活率。值得注意的是，獲得足夠量的RNA是本技術(shù)的前提，因此，如何在體外獲得足夠量的成熟mRNA至關(guān)重要。采用體外轉(zhuǎn)錄完整mRNA的體系，不失為一值得選擇的方法。

總之，建立的體外轉(zhuǎn)錄及電轉(zhuǎn)mRNA至抗CD3抗體刺激的PBMC的優(yōu)化條件，可成功地重塑細(xì)胞，表達(dá)轉(zhuǎn)入的外源基因。該技術(shù)為未來制備表達(dá)腫瘤反應(yīng)性CDR3移植γδTCR的新型基因工程細(xì)胞制備提供新的技術(shù)支持。

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Establishment of an electroporation method fortransfection of mRNA into anti-CD3 antibody stimulated human PBMC

HU Yu1, ZHAO Hui1,2, WANG Zhun1, HE Wei1*

(1.Dept of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; School of Basic Medicine, PUMC；State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Beijing 100005; 2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050，China)

ObjectiveTo establish an electroporation method to transfect mRNA into human PBMCs for the preparation of CDR3-grafted γδ T lymphocytes.MethodsLinearized plasmids pGEM4Z/EGFP/A64 containing EGFP cDNA fragment by the digestion with restriction endonucleaseSpeⅠ were used as templates forEGFPmRNA transcription.EGFPmRNA was transfected into anti-CD3 antibody-stimulated human PBMC by electroporation instrument under different conditions with 500 V and 500 μs, 400 V and 500 μs or 300 V and 500 μs, respectively. The levels of EGFP expression in the cells electroporated withEGFPmRNA were evaluated through inverted fluorescence microscope and flow cytometry. The survival rates of transfected-cells were measured by trypan blue staining.

ResultsAgarose electrophoresis showed that pGEM4Z/EGFP/A64 plasmids were well linearized bySpeⅠ digestion andEGFPmRNAs were successfully transcribedinvitro. 48 hours after mRNA-transfection, EGFP expression in cells transfectedEGFPmRNAs under the condition of 500 V and 500 μs attained 77% which were significantly higher than those in cells transfectedEGFPmRNAs under other conditions. The survival rate of transfected cells under the condition of 500 V and 500 μs reached up to 85%.ConclusionsThe electroporation platform of mRNA transfection into human PBMC with parameters of 500 V and 500 μs is successfully established and may be useful to prepare genetically modified T lymphocytes by mRNA transfection.

mRNA; electroporation; PBMC; EGFP

2014- 03- 19

2014- 04- 11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA020901)

*通信作者(correspondingauthor)：mianyi333@163.com

1001-6325(2014)06-0782-05

R 392.12

A