姜黃素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1 RECK基因表達(dá)及甲基化的影響

王柏琦，陳艷華，蔣麗琴，程愛(ài)蘭

(南華大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科； 2.醫(yī)學(xué)院 腫瘤研究所, 湖南 衡陽(yáng) 421001)

研究論文

姜黃素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1RECK基因表達(dá)及甲基化的影響

王柏琦1,2，陳艷華1，蔣麗琴1，程愛(ài)蘭2*

(南華大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科； 2.醫(yī)學(xué)院 腫瘤研究所, 湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的探討姜黃素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞RECK基因表達(dá)及甲基化的影響，并探討可能的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1，用1、10和30 μmol/L 姜黃素處理后，用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)RECK基因以及DNA甲基化酶1(DNMT1)的蛋白和mRNA表達(dá)；高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)RECK甲基化，同時(shí)用MTT檢測(cè)CNE-1細(xì)胞增殖，EMSA法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的DNA結(jié)合活性。結(jié)果CNE-1細(xì)胞未刺激時(shí)RECK表達(dá)水平較低，而經(jīng)1～30 μmol/L姜黃素處理后，能顯著增強(qiáng)RECK蛋白和mRNA的表達(dá)(Plt;0.05)。30 μmol/L 姜黃素處理CNE-1細(xì)胞后，RECK啟動(dòng)子甲基化水平降低至31% (Plt;0.05)，全基因組甲基化水平降低39% (Plt;0.05)，細(xì)胞系的甲基化活性減少了72% (Plt;0.05)。同時(shí)，姜黃素能顯著降低CNE-1細(xì)胞中DNMT1的蛋白和mRNA表達(dá) (Plt;0.05)，也能減低CNE-1細(xì)胞的存活率 (Plt;0.05)。EMSA結(jié)果顯示，姜黃素處理后，CNE-1細(xì)胞中Sp1的DNA活性顯著降低。結(jié)論姜黃素可能通過(guò)上調(diào)RECK基因表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)甲基化水平，從而抑制CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)。

鼻咽癌；伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(RECK)；甲基化；姜黃素

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病情隱匿，惡性程度高且較早發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。鼻咽癌的病因很多，病毒感染、家族史、營(yíng)養(yǎng)狀況、年齡等因素均與本病的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)[2]。近年來(lái)，DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谀[瘤中的發(fā)病日益受到重視[3]。正常情況下，DNA甲基化是機(jī)體內(nèi)一種基本生理過(guò)程，它在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶(5′-cytosine-guanosine)，這在維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方面發(fā)揮重要作用[4]。然而在某些病理?xiàng)l件下，DNA異常甲基化可導(dǎo)致多種癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，如伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs, RECK)、Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)等，而這些抑癌基因的失活與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。

姜黃素是一種二酮類化合物，已有研究顯示姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[6]。但姜黃素能否影響鼻咽癌細(xì)胞中RECK基因的甲基化，目前仍不清楚。本研究擬從姜黃素入手，觀察食源性物質(zhì)能否影響鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系中RECK基因的表達(dá)和甲基化，以此為腫瘤鼻咽癌的預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素(純度98%)、甲醇、乙腈(HPC級(jí)別)、甲酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、地西他濱、5-甲基2-脫氧胞苷(5mdC)、2-脫氧鳥(niǎo)苷、核酸磷酸酶、蛇毒液磷酸酶、堿性磷酸酶、堿磷酸去氧核苷酸(2.5 mmol/L)(Sigma公司)。EpiQuik DNMT活性檢測(cè)試劑盒(Epigentek公司)，DNeasy DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，核蛋白提取試劑盒(Pierce公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與活性鑒定

CNE-1鼻咽癌細(xì)胞系(ATCC)用含有10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。100 μL細(xì)胞(約3×103個(gè))接種于96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，每組設(shè)3復(fù)孔。第2天換成含5%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，并加入不同濃度的姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。結(jié)束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL(5 g/L)，隨后棄上清，并加入200 μL二甲基亞砜，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A570)，并計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)室A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.3 Western blot與甲基化活性分析

細(xì)胞處理完畢后，800 r/min離心5 min，棄上清，冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入200 μL細(xì)胞裂解緩沖液重懸浮細(xì)胞(裂解液含蛋白酶抑制劑cocktail Set Ⅲ，1 mmol/L β-甘油磷酸酯、1 mmol/L 釩酸鈉、1 mmol/L氟化鈉、1 mmol/L 苯甲磺?；?、20 mmol/L pH 7.0 HEPES、150 mmol/L NaCl、 0.1% NP40)，冰上裂解40 min。1 000 r/min離心15 min后，獲取上清。經(jīng)5%～15%聚丙烯酰胺凝膠電泳后， Western blot檢測(cè)RECK或DNMT1的表達(dá)。CNE-1細(xì)胞核蛋白中的甲基化活性按EpiQuikTMDNMT試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 DNA提取和水解

獲取1×107個(gè)姜黃素處理后的CNE-1細(xì)胞，按照Qiagen試劑盒操作步驟提取基因組DNA用于全細(xì)胞甲基化分析。DNA根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]提供的方法進(jìn)行，即200 ng基因組DNA于100 ℃、3 min熱處理變性，置于冰上冷卻后，加入1/10體積的醋酸銨(0.1 mol/L，pH 5.3)和2 U的核酸酶P1，45 ℃孵育2 h后，加入1/10體積的NH4HCO3(1 mol/L)和0.002 U的毒液磷酸二酯酶 Ⅰ，37 ℃孵育1 h。隨后加入0.5 U堿性磷酸酶，37 ℃培養(yǎng)1 h。

1.5高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)檢測(cè)DNA甲基化

液相色譜包括HPLC 系統(tǒng)(Agilent公司1100型)、色譜柱(Waters公司Atlantis dC18柱)和預(yù)柱(Waters公司)。流動(dòng)相為0.1%甲酸-甲醇，流速為0.2 mL/min。電噴霧離子模式為正離子，掃描范圍為m/z 100～2 000， 離子源溫度450 ℃， 噴霧電壓為415 kV，破簇電壓為55 V，入口電壓6 V。碰撞能13 V，氣簾氣為138 kPa, 氣體1為221 kPa, 氣體2為379 kPa, 碰撞氣體為41 kPa[7]。采用Sciex Analyst software軟件(版本1.3.1) 處理數(shù)據(jù)。

1.6 Real-time RT-PCR分析

采用定量RT-PCR檢測(cè)RECK和NDMT1的表達(dá)。細(xì)胞處理完畢，用Trizol試劑提取總RNA，取2 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件是： 50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min， 然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI prism 7700上進(jìn)行。所得的數(shù)據(jù)與內(nèi)參(18S)之比作為相對(duì)值。

1.7 電泳遷移位移實(shí)驗(yàn)(EMSA)

根據(jù)試劑盒步驟提取核蛋白，核提取物和32P標(biāo)記的含Sp1基序的寡核苷酸和DNMT1啟動(dòng)子寡核苷酸進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，步驟按照參考文獻(xiàn)[8]提供的方法進(jìn)行。提取的核蛋白加入化學(xué)合成的含Sp1結(jié)合位點(diǎn)的DNMT1啟動(dòng)子區(qū)寡核苷酸探針?；パa(bǔ)寡核苷酸、退火，并用Klenow片段標(biāo)記32P-dCTP。

2 結(jié)果

2.1姜黃素增加CNE-1細(xì)胞RECKmRNA和蛋白表達(dá)

CNE-1細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下RECK蛋白表達(dá)水平較低，而經(jīng)10和30 μmol/L 姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)RECK蛋白的表達(dá)顯著增高(圖1A)。不同濃度的姜黃素也能增強(qiáng)其mRNA的表達(dá)，其趨勢(shì)與蛋白表達(dá)一致(圖1B)。

A.RECK protein expression detected by Western blot；B.RECK mRNA expression by real time PCR； 1.control；2.1 μmol/L curcumin；3.10 μmol/L curcumin; 4.30 μmol/L curcumin； *Plt;0.05 compared with control圖1 姜黃素對(duì)CNE-1細(xì)胞RECK mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Effect of curcumin on RECK mRNA and protein expression in CNE-1 cells

2.2姜黃素降低RECK啟動(dòng)子區(qū)域以及全基因組以及細(xì)胞核DNA甲基化

30 μmol/L 姜黃素處理CNE-1細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，RECK啟動(dòng)子甲基化水平降低了31%，全基因組甲基化水平降低39%，CNE-1細(xì)胞核的甲基化活性減少了72%(Plt;0.01)(表1)。

表1 姜黃素對(duì)CNE-1細(xì)胞RECK基因啟動(dòng)子、全基因以及細(xì)胞核蛋白甲基化活性的影響

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control.

2.3 姜黃素下調(diào)CNE-1細(xì)胞DNMT1表達(dá)水平

CNE-1細(xì)胞DNMT1表達(dá)水平較高，而用1、10或30 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞后，DNMT1蛋白水平顯著降低(圖2A)，其mRNA表達(dá)也相應(yīng)減少(圖2B)。

A.DNMT1 protein expression detected by Western blot；B.DNMT1 mRNA expression by real time PCR; 1.control； 2.1 μmol/L curcumin；3.10 μmol/L curcumin; 4.30 μmol/L curcumin; *Plt;0.05 compared with control圖2 姜黃素對(duì)CNE-1細(xì)胞DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of curcumin on DNMT1 mRNA and protein expression in CNE-1 cells

2.4姜黃素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖以及對(duì)Sp1轉(zhuǎn)錄因子的影響

CNE-1細(xì)胞在濃度為10和30 μmol/L姜黃素作用下的存活率分別為44%和23%。此外，姜黃素也能呈劑量依賴性方式降低CNE-1細(xì)胞Sp1的DNA結(jié)合活性(圖3泳道2～4)，而加入100倍劑量未標(biāo)記的Sp1競(jìng)爭(zhēng)探針(冷探針)后(圖3泳道5)，對(duì)照組的滯后條帶減弱，而非特異性競(jìng)爭(zhēng)探針對(duì)滯后條帶無(wú)明顯影響(圖3泳道6)。

A.cytotoxicityof curcumin was evaluated using MTT assay；B.DNA-binding activity of Sp1 by EMSA; 1.control；2.1 μmol/L curcumin；3.10 μmol/L curcumin; 4.30 μmol/L curcumin; 5.control nuclear extracts with 32P-labed oligonucleotides and 100× unlabed Sp1 oligonucleotides; 6: control nuclear extracts with 32P-labed oligonucleotides and 100× unlabed NF-κB oligonucleotides； *Plt;0.05 compared with control圖3 姜黃素對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖以及Sp1 DNA結(jié)合活性的影響Fig 3 The anti-proliferative activity and Sp1 DNA- binding activity of curcumin in CNE-1 cells

3 討論

RECK基因是一種抑癌基因，廣泛存在于機(jī)體各種組織細(xì)胞中，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等功能。而在胃癌、胰腺癌、乳腺癌以及食管癌等惡性腫瘤細(xì)胞中RECK基因呈低表達(dá)，且基因中存在異常的甲基化[9]。本研究證實(shí)姜黃素能有效上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中因甲基化而失活的RECK基因mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)，RECK的激活還與降低其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。此外，姜黃素也能抑制CNE-1細(xì)胞中DNMT1表達(dá)，并能影響Sp1的DNA結(jié)合活性，因此姜黃素對(duì)DNMT1的抑制可能是通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1而實(shí)現(xiàn)的。因此，姜黃素可能通過(guò)抑制DNMT1的表達(dá)，從而抑制RECK基因DNA甲基化而增強(qiáng)其抑制腫瘤生長(zhǎng)功能，最終抑制鼻咽癌生長(zhǎng)增殖。姜黃素抑制DNMT1的表達(dá)，降低RECK啟動(dòng)子甲基化從而重新激活RECK，這可能是其化學(xué)預(yù)防鼻咽癌的一種新的分子機(jī)制。有研究顯示，使用姜黃素處理鼻咽癌細(xì)胞，能導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)增高以及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這與核苷酸DNA甲基化抑制劑相似[10]。此外，一些超甲基化沉默的抑癌基因如GSTP1和MGMT也能被其他外源性藥物重新激活[11]，這也從側(cè)面證明了姜黃素能誘導(dǎo)DNA去甲基化以及重新激活由此沉默的抑癌基因。

表觀遺傳學(xué)化學(xué)療法是近年逐漸開(kāi)展的一種新型治療策略，并已在白血病治療中取得了一定的效果[12]。目前，DNA去甲基化試劑如地西他濱和氮胞苷已經(jīng)在臨床上用于骨髓增生異常綜合征的治療[13]。但是，要實(shí)現(xiàn)這種新療法的臨床應(yīng)用對(duì)包括鼻咽癌在內(nèi)的實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)還有待進(jìn)一步研究，姜黃素作為一種去甲基化藥物可能為鼻咽癌提供一種新的預(yù)防手段，因?yàn)榻S素不良反應(yīng)低，可長(zhǎng)期使用，來(lái)源豐富。細(xì)胞周期研究證實(shí)姜黃素能將鼻咽癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，并能顯著降低S期細(xì)胞比例。此外，對(duì)于那些無(wú)復(fù)制功能的細(xì)胞群如干細(xì)胞，氮胞苷類藥物往往無(wú)效。因此與依賴于S期的氮胞苷類藥物相比，姜黃素的適用范圍更廣。

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Effect of curcumin on RECK expressionand methylation in nasopharyngeal carcinoma cells CNE-1

WANG Bai-qi1,2, CHEN Yan-hua1, JIANG Li-qin1, CHENG Ai-lan2*

(1.Dept. of Oncology，the Second Affiliated Hospital, University of South China;2.Cancer Research Institute, Medical College, University of South China, Hengyang 421001, China)

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs (RECK) gene expression and methylation, and then to analyze potential mechanism.MethodsNasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 was cultured, and stimulated by 1, 10 and 30 μmol/L curcumin for 48 h, expression of RECK and DNA methyltransferases 1 (DNMT1) gene mRNA and protein were examined by Western blot and real-time PCR respectively.RECKmethylation was determined by HPLC chromatographic and mass spectrometric methods. Cell proliferation was assessed by MTT assay, and the DNA-binding activity of nuclear factor Sp1 was detected by EMSA.ResultsThe expression level of RECK was very low in unstimulated cells, and 1～30 μmol/L could decrease the protein and mRNA level (Plt;0.05). 30 μmol/L of curcumin could decrease the promoter methylation level to 31% of the basal level (Plt;0.05), and the global DNA methylation level and the methylation activity of the nuclear extract were also decreased about 39% (Plt;0.05) and 72% (Plt;0.05),respectively. Western blot showed that curcumin may also decrease the protein and mRNA level of DNMT1 (Plt;0.05) and survival rate (Plt;0.05). In addition, the DNA-binding activity of Sp1 decreased after curcumin treatment.ConclusionsCurcumin may inhibit CNE-1 cells growth by up-regulation ofRECKgene expression and down-regulation of its methylation.

nasopharyngeal carcinoma; reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs (RECK); methylation; curcumin

2013- 10- 21

2013- 12- 24

國(guó)家自然科學(xué)基金(81372894)

*通信作者(correspondingauthor)：ailan_cheng@hotmail.com

1001-6325(2014)06-0729-05

R 739.62

A