復(fù)方一枝蒿片體內(nèi)外抗菌作用研究

葛海濤 王曉磊 蘇愷琪 陶元明 唐俊

復(fù)方一枝蒿片為江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司研制、生產(chǎn)的新型中草藥成品，其主要成分為一枝蒿、板藍(lán)根和大青葉，按照維醫(yī)理論，其具有清除“乃孜來”，解毒利咽，用于“乃孜來”所致的感冒、發(fā)燒、咽喉腫痛的功效；在中醫(yī)學(xué)中其具有解表祛風(fēng)、涼血解毒的療效。常用于邪毒所致的感冒發(fā)燒、咽喉腫痛、病毒性感冒見上述證候者。相對于復(fù)方一枝蒿顆粒，該產(chǎn)品能夠克服顆粒劑用輔料用量大、服用需用開水沖服、口味不佳等缺點(diǎn)。為了進(jìn)一步開發(fā)復(fù)方一枝蒿片，筆者對其在抗菌方面的藥效作用進(jìn)行了研究，以期為復(fù)方一枝蒿片的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 紫外分光光度計（UV-2201）：日本島津公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（5417R）：艾本德中國有限公司（Eppendorf China Limited）；電子分析天平（AG-204）：瑞士Mettler Toledo公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ）：上海屹明凈化設(shè)備有限公司。

1.1.2 試藥 地塞米松（湖北潛江制藥股份有限公司）；MH肉湯培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基（上海微晶生物技術(shù)有限公司）；雙黃連口服液（河南福森藥業(yè)有限公司）；復(fù)方一枝蒿片（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)前用滅菌蒸餾水溶解配成所需濃度）；MH血清肉湯培養(yǎng)基和MH血瓊脂平板培養(yǎng)基（分別為肉湯加滅活小牛血清，瓊脂培養(yǎng)基加脫纖維羊血）由本室制備。

1.1.3 動物及菌種 Balb/c小鼠300只，雌雄兼半，6～7周齡，購自上海斯萊克動物公司；金黃色葡萄球菌ATCC 25923；大腸桿菌 ATCC 58922由江蘇省藥品檢驗(yàn)所提供；肺炎鏈球菌 ATCC 49619；乙型溶血性鏈球菌ATCC 6305。

1.2 方法

1.2.1 體外抗菌實(shí)驗(yàn) 采用試管法測最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）研究復(fù)方一枝蒿片的體外抗菌研究[1-3]。

1.2.1.1 試驗(yàn)菌準(zhǔn)備 取復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）MH肉湯24 h培養(yǎng)物分別接種至MH肉湯，37 ℃ 孵育6 h；取復(fù)蘇的肺炎鏈球菌（Pseudomonas aureginosa）和乙型溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolytic-β）MH血清肉湯 24 h培養(yǎng)物分別接種至MH血清肉湯，37 ℃，6 h；分別取上述4種菌6 h培養(yǎng)液，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)至109/mL，再作100倍稀釋至107/mL，將107/mL定為工作濃度。通過傾注平板作菌落計數(shù)，最終確定每1 mL液體培養(yǎng)基中加入0.1 mL菌液。

1.2.1.2 復(fù)方一枝蒿水溶液制備 取復(fù)方一枝蒿片5 g加15 mL滅菌蒸餾水中，通過超聲處理，使復(fù)方一枝蒿片充分溶解，用1 % NaOH調(diào)至pH 7.0，用0.5 μm濾器濾過除菌，呈棕黃色透明液體。

1.2.1.3 抗菌實(shí)驗(yàn) 復(fù)方一枝蒿水溶液1 mL，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用MH肉湯，乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌用MH血清肉湯分別作倍比稀釋至第10管，第11管為菌液對照，第12管為MH肉湯無菌對照。1～10管藥液稀釋度分別為1：2，1：4～1：1024，共4排。每排1～11管分別加入4種試驗(yàn)菌液0.1 mL，第12管不加菌液，為MH肉湯無菌對照，37 ℃，24 h，觀察結(jié)果。

將上述各管（1～6）分別作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋，每管不同稀釋度分別取1mL培養(yǎng)液加10 mL營養(yǎng)瓊脂，乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌用血平板，混勻，每管每個濃度混合液均傾注3塊平板，37 ℃ 孵育24 h。

1.2.2 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn) 取Balb/c小鼠20只， 隨機(jī)均分為10組：1、2組為生理鹽水（20 mL/kg）； 3、4 組為雙黃連口服液組（10 mL/kg）；5、6 組為復(fù)方一枝蒿低劑量組（L組，15.1 g/kg）；7、8 組為復(fù)方一枝蒿中劑量組（M 組，30.2 g/kg）；9、10組為復(fù)方一枝蒿高劑量組（H組，60.4 g/kg）。 各組藥物劑量為 20 mL/kg，ig，1 次 /d， 連續(xù) 3 d 。末次給藥后 1 h，ip 大腸桿菌培養(yǎng)液（ 1、3、5、7、9 組） 和變形桿菌培養(yǎng)液（ 2、4、6、8、10組） ，每只0.5 mL，觀察72 h內(nèi)動物死亡情況，并進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計分析[4-5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用PEMS 3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)

數(shù)據(jù)采用 字2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

MH肉湯結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌感染的肉湯都有一定程度的變澄清，復(fù)方一枝蒿片對、肺炎鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌有抑制和殺滅作用，見表1。MH平板結(jié)果見表2。

表1 復(fù)方一枝蒿抗菌實(shí)驗(yàn)MH肉湯培養(yǎng)結(jié)果

表2 復(fù)方一枝蒿抗菌實(shí)驗(yàn)MH平板培養(yǎng)結(jié)果

分別計算4種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），見表3。

復(fù)方一枝蒿片對大腸桿菌和變形桿菌感染小鼠的保護(hù)作用詳見表4。由表4可知，復(fù)方一枝蒿片對大腸桿菌感染小鼠死亡的保護(hù)作用不顯著；在較高的劑量（60.4 g/kg）時，復(fù)方一枝蒿片使變形桿菌感染小鼠死亡率顯著下降，顯示有顯著的保護(hù)作用。

表3 復(fù)方一枝蒿片的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

表4 復(fù)方一枝蒿片對大腸桿菌和變形桿菌感染小鼠的保護(hù)作用

3 討論

上述研究顯示，復(fù)方一枝蒿片劑能夠明顯抑制和殺滅金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌，對乙型溶血性鏈球菌有一定的抑制和殺滅作用，而對大腸桿菌無作用。同為上呼吸道感染常見病原菌的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌都可以被復(fù)方一枝蒿片所抑制和殺滅，這可以解釋臨床上常用復(fù)方一枝蒿片治療咽炎、喉炎和氣管炎等上呼吸道感染的原因。上述三種病原菌均為革蘭陽性球菌，而大腸桿菌屬于革蘭陰性菌，而革蘭陽性球菌和革蘭陰性菌具有不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[6]，復(fù)方一枝蒿片對前述各菌抑制和殺滅作用的確切作用機(jī)制是否與其阻止細(xì)胞壁合成有關(guān)[7]，還有待于進(jìn)一步研究。復(fù)方一枝蒿片對大腸桿菌感染小鼠死亡的保護(hù)作用不顯著，但是高劑量的復(fù)方一枝蒿片能使變形桿菌感染小鼠的死亡率顯著下降，表明復(fù)方一枝蒿片對感染的小鼠具有明顯的保護(hù)作用。綜上所述，一枝蒿片具有良好的抗菌作用，但其作用機(jī)制未知，有待于進(jìn)一步研究。

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