劉博,程樹杰
(河北大學,河北 保定 071000)
黃藥子為薯蕷科 (Dioscoreaceae)黃獨(Dioscorea bulbifera L)的塊莖[1]。黃藥子具有涼血、降火、消癭、解毒、化痰散結的功效,可用于治療多種疾病[2-4],具有一定的毒性[5],同時,近年來研究以黃藥子為主藥的中藥制劑可用于治療各種腫瘤[6]。隨著黃藥子藥理作用的研究,其抗腫瘤活性成分也受到了極大的關注[7],其中黃獨乙素(Diosbulbin B)是黃藥子中所含的主要生物堿之一,在黃藥子抗腫瘤活性得到研究證實的同時,研究發(fā)現(xiàn)黃獨乙素對胃癌具有治療作用[8]。本研究實驗通過比較黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞及其耐藥細胞株的增殖抑制效果,從而闡明黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用是否受到該細胞株對其他化療藥物耐藥的影響。
黃獨乙素(四川省維克奇生物科技有限公司),注射用順鉑、5-FU、阿霉素,四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國sigma公司)。黃獨乙素溶解在DMSO中,濃度為800μmol/L,4℃保存;順鉑、5-FU、阿霉素溶解于DMSO中,濃度為400μmol/L,4℃保存,實驗中用相應的培養(yǎng)液或溶劑稀釋。人低分化胃腺癌細胞株SGC-7901(河北大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供)。實驗分為4個大組進行,根據(jù)使用細胞株的不同分為SGC-7901細胞株實驗組、SGC-7901/順鉑細胞株實驗組、SGC-7901/5-FU細胞株實驗組、SGC-7901/阿霉素細胞株實驗組,根據(jù)黃獨乙素毒理作用[5],四組均采用10μmol/L、20μ mol/L、40μ mol/L、80μ mol/L、160μmol/L濃度黃獨乙素處理,陰性對照組為不含黃獨乙素的等量DMSO,空白組為等量培養(yǎng)基。
1.2.1 胃癌耐藥細胞株的建立
選取處于對數(shù)生長期細胞,向培養(yǎng)瓶內加入不同濃度的順鉑、5-FU、阿霉素,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育48 h后撤藥,繼續(xù)觀察細胞的死亡情況3 d,選擇含順鉑、5-FU、阿霉素濃度分別為5、10、2μmol/L的完全RPMI-1640培養(yǎng)液(約20%的抑制濃度)作為耐藥細胞培養(yǎng)的起始濃度,設定順鉑濃度梯度為5—10—15—20—25—30—35—40—45—50μmol/L,5-FU濃度梯度為10—20—30—40—50—60—70—80—90—100μ mol/L,阿霉素濃度梯度為 2—4—6—8—10—12—14—16—18—20μmol/L。
1.2.2 MTT用于細胞增殖及細胞活性測定
測定黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU、SGC-7901/阿霉素細胞增殖的影響。
1.2.3 計算抑制率
1.2.4 統(tǒng)計學處理
所有計量資料以x±s表示,應用SPSS16.0軟件進行方差分析,P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義,P>0.05表明差異無統(tǒng)計學意義。
由所取得數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn),4種細胞株分別加入10μmol/L、20μmol/L、40μ mol/L、80μmol/L、160μmol/L黃獨乙素所測得的吸光度與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),(表1);同時,3種耐藥細胞株與加入同樣濃度黃獨乙素的SGC-7901細胞株所測得的抑制率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),(表 2)。
表1 4種細胞株實驗組加入不同濃度黃獨乙素所測得吸光度(x±s)
表2 4種細胞株實驗組加入不同濃度黃獨乙素所測得抑制率(x±s)
2.2.1 不同濃度的黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株抑制率影響
加入相同濃度黃獨乙素后SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株抑制率接近,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1、表2),表明黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞株的增殖抑制作用并沒有受到細胞株對順鉑、5-FU、阿霉素耐藥的影響。
圖1 黃獨乙素對4種細胞株的抑制率
2.2.2 加入不同濃度黃獨乙素后SGC-7901細胞株及其耐藥細胞株抑制率變化曲線
黃獨乙素對SGC-7901細胞株及其耐藥細胞株的增殖抑制率隨濃度變化曲線非常相似,表明黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株具有相似的增殖抑制作用,并且呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性,也就是說黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞株增殖抑制作用的劑量依賴性并未受到細胞株對順鉑、5-FU及阿霉素產生耐藥的影響(圖2)。
圖2 4種細胞株抑制率隨黃獨乙素濃度變化曲線
隨著研究逐漸深入,中藥抗腫瘤機制也逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實,目前人們所證實的中藥的抗腫瘤作用有:(1)增強機體免疫力,中藥可以調控體內的淋巴細胞產生一些如IL、TNF等細胞因子,進而增強患者體內的免疫調節(jié)功能[9];(2)直接抑制腫瘤細胞生長與增殖,中藥可作用于腫瘤細胞生長的不同階段,嚴重阻礙細胞生長所需要DNA、RNA 蛋白質的合成,使腫瘤細胞停止于增殖周期某階段; 或作用于腫瘤細胞能量代謝某環(huán)節(jié),導致腫瘤細胞呼吸鏈受阻而死亡; 或破壞細胞膜引起細胞自溶死亡[9];(3)抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力,大多數(shù)腫瘤細胞具有很強的侵襲轉移能力,也是腫瘤患者在短時間內死亡的主要原因,中藥可以有效降低腫瘤細胞的侵襲能力,延緩其轉移速度[10];(4)誘導腫瘤細胞的凋亡,腫瘤的發(fā)生多源于抑癌基因的失活或者原癌基因的激活,中藥可通過促使異常表達的癌基因得到逆轉、關閉或降低而達到抑癌作用[11];(5)改變或阻滯腫瘤細胞的周期,中藥可作用于腫瘤細胞不同的細胞周期,使之發(fā)生停滯或者分化以達到抑癌作用[12];(6)抑制腫瘤血管生成,腫瘤細胞不可能脫離血供而快速增殖,中藥可抑制腫瘤血管生成,通過減少腫瘤組織的血供來抑制腫瘤生長[13];(7)逆轉多藥耐藥,增強常規(guī)化療藥物的作用,腫瘤細胞對常規(guī)化療藥物的多藥耐藥是化療中的重要難題,中藥可以通過多種方式降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥程度,從而輔助化療藥物抑制腫瘤生長[14]。目前黃獨乙素抑制癌瘤細胞增殖的具體機制仍不完全清楚,本實驗發(fā)現(xiàn),黃獨乙素能夠直接抑制人胃癌SGC-7901細胞的生長和增殖,證實,黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞具有明顯抑制細胞增殖的作用,雖然未檢測發(fā)現(xiàn)其有效濃度區(qū)間,但效果仍然值得關注,黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出一定程度的濃度依賴性。近年來國內發(fā)表多篇關于黃藥子及黃獨乙素抗腫瘤作用的類似報道[15-17],但不排除黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制存在其他方面的機制,需進一步研究。
當前臨床應用的一線化療藥物之間,或多或少存在著一定程度的交叉耐藥,當腫瘤對于某一種化療藥物產生耐藥后,其他化療藥物對該腫瘤所產生的抑制效果有一定程度的降低,尤其是相同作用機制的化療藥物[18]。以往國內外中藥的研究多針對其自身對腫瘤細胞的增殖抑制作用,而中藥對腫瘤細胞的耐藥細胞株的增殖抑制作用研究較少,近年來,國內外學者將目光轉向了中藥的輔助化療作用,比如有效抑制耐藥細胞增殖、逆轉多藥耐藥等研究方向[19]。黃獨乙素在本實驗中表現(xiàn)出對人胃癌SGC-7901細胞的低交叉耐藥性,人胃癌SGC-7901細胞對順鉑、5-FU、阿霉素產生耐藥并未影響黃獨乙素對其增殖抑制效果,這是傳統(tǒng)化療藥物難以克服的難題,也是化療失敗或者效果欠佳的主要原因,同樣也是當前研究所希望發(fā)現(xiàn)的中藥輔助化療的作用。黃獨乙素作為中藥單一成分所表現(xiàn)出來的這種低交叉耐藥性是未來研究中開發(fā)新型化療藥物應該重視的,也是未來中藥抗腫瘤研究的熱點。
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