黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞及其耐藥細胞株體外抑制作用的研究

劉博，程樹杰

（河北大學，河北 保定 071000）

黃藥子為薯蕷科 （Dioscoreaceae）黃獨（Dioscorea bulbifera L）的塊莖[1]。黃藥子具有涼血、降火、消癭、解毒、化痰散結的功效，可用于治療多種疾病[2-4]，具有一定的毒性[5]，同時，近年來研究以黃藥子為主藥的中藥制劑可用于治療各種腫瘤[6]。隨著黃藥子藥理作用的研究，其抗腫瘤活性成分也受到了極大的關注[7]，其中黃獨乙素（Diosbulbin B）是黃藥子中所含的主要生物堿之一，在黃藥子抗腫瘤活性得到研究證實的同時，研究發(fā)現(xiàn)黃獨乙素對胃癌具有治療作用[8]。本研究實驗通過比較黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞及其耐藥細胞株的增殖抑制效果，從而闡明黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用是否受到該細胞株對其他化療藥物耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨乙素（四川省維克奇生物科技有限公司），注射用順鉑、5-FU、阿霉素，四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國sigma公司）。黃獨乙素溶解在DMSO中，濃度為800μmol/L，4℃保存；順鉑、5-FU、阿霉素溶解于DMSO中，濃度為400μmol/L，4℃保存，實驗中用相應的培養(yǎng)液或溶劑稀釋。人低分化胃腺癌細胞株SGC-7901（河北大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供）。實驗分為4個大組進行，根據(jù)使用細胞株的不同分為SGC-7901細胞株實驗組、SGC-7901/順鉑細胞株實驗組、SGC-7901/5-FU細胞株實驗組、SGC-7901/阿霉素細胞株實驗組，根據(jù)黃獨乙素毒理作用[5]，四組均采用10μmol/L、20μ mol/L、40μ mol/L、80μ mol/L、160μmol/L濃度黃獨乙素處理，陰性對照組為不含黃獨乙素的等量DMSO，空白組為等量培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 胃癌耐藥細胞株的建立

選取處于對數(shù)生長期細胞，向培養(yǎng)瓶內加入不同濃度的順鉑、5-FU、阿霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育48 h后撤藥，繼續(xù)觀察細胞的死亡情況3 d，選擇含順鉑、5-FU、阿霉素濃度分別為5、10、2μmol/L的完全RPMI-1640培養(yǎng)液(約20%的抑制濃度)作為耐藥細胞培養(yǎng)的起始濃度，設定順鉑濃度梯度為5—10—15—20—25—30—35—40—45—50μmol/L，5-FU濃度梯度為10—20—30—40—50—60—70—80—90—100μ mol/L，阿霉素濃度梯度為 2—4—6—8—10—12—14—16—18—20μmol/L。

1.2.2 MTT用于細胞增殖及細胞活性測定

測定黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU、SGC-7901/阿霉素細胞增殖的影響。

1.2.3 計算抑制率

1.2.4 統(tǒng)計學處理

所有計量資料以x±s表示，應用SPSS16.0軟件進行方差分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05表明差異無統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 收集MTT數(shù)據(jù)（吸光度），計算抑制率

由所取得數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，4種細胞株分別加入10μmol/L、20μmol/L、40μ mol/L、80μmol/L、160μmol/L黃獨乙素所測得的吸光度與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），（表1）；同時，3種耐藥細胞株與加入同樣濃度黃獨乙素的SGC-7901細胞株所測得的抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），（表 2）。

表1 4種細胞株實驗組加入不同濃度黃獨乙素所測得吸光度（x±s）

表2 4種細胞株實驗組加入不同濃度黃獨乙素所測得抑制率（x±s）

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 不同濃度的黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株抑制率影響

加入相同濃度黃獨乙素后SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株抑制率接近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1、表2），表明黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞株的增殖抑制作用并沒有受到細胞株對順鉑、5-FU、阿霉素耐藥的影響。

圖1 黃獨乙素對4種細胞株的抑制率

2.2.2 加入不同濃度黃獨乙素后SGC-7901細胞株及其耐藥細胞株抑制率變化曲線

黃獨乙素對SGC-7901細胞株及其耐藥細胞株的增殖抑制率隨濃度變化曲線非常相似，表明黃獨乙素對SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細胞株具有相似的增殖抑制作用，并且呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，也就是說黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞株增殖抑制作用的劑量依賴性并未受到細胞株對順鉑、5-FU及阿霉素產生耐藥的影響（圖2）。

圖2 4種細胞株抑制率隨黃獨乙素濃度變化曲線

3 討論

隨著研究逐漸深入，中藥抗腫瘤機制也逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實，目前人們所證實的中藥的抗腫瘤作用有：（1）增強機體免疫力，中藥可以調控體內的淋巴細胞產生一些如IL、TNF等細胞因子，進而增強患者體內的免疫調節(jié)功能[9]；（2）直接抑制腫瘤細胞生長與增殖，中藥可作用于腫瘤細胞生長的不同階段，嚴重阻礙細胞生長所需要DNA、RNA 蛋白質的合成，使腫瘤細胞停止于增殖周期某階段； 或作用于腫瘤細胞能量代謝某環(huán)節(jié)，導致腫瘤細胞呼吸鏈受阻而死亡； 或破壞細胞膜引起細胞自溶死亡[9]；（3）抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，大多數(shù)腫瘤細胞具有很強的侵襲轉移能力，也是腫瘤患者在短時間內死亡的主要原因，中藥可以有效降低腫瘤細胞的侵襲能力，延緩其轉移速度[10]；（4）誘導腫瘤細胞的凋亡，腫瘤的發(fā)生多源于抑癌基因的失活或者原癌基因的激活，中藥可通過促使異常表達的癌基因得到逆轉、關閉或降低而達到抑癌作用[11]；（5）改變或阻滯腫瘤細胞的周期，中藥可作用于腫瘤細胞不同的細胞周期，使之發(fā)生停滯或者分化以達到抑癌作用[12]；（6）抑制腫瘤血管生成，腫瘤細胞不可能脫離血供而快速增殖，中藥可抑制腫瘤血管生成，通過減少腫瘤組織的血供來抑制腫瘤生長[13]；（7）逆轉多藥耐藥，增強常規(guī)化療藥物的作用，腫瘤細胞對常規(guī)化療藥物的多藥耐藥是化療中的重要難題，中藥可以通過多種方式降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥程度，從而輔助化療藥物抑制腫瘤生長[14]。目前黃獨乙素抑制癌瘤細胞增殖的具體機制仍不完全清楚，本實驗發(fā)現(xiàn)，黃獨乙素能夠直接抑制人胃癌SGC-7901細胞的生長和增殖，證實，黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞具有明顯抑制細胞增殖的作用，雖然未檢測發(fā)現(xiàn)其有效濃度區(qū)間，但效果仍然值得關注，黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出一定程度的濃度依賴性。近年來國內發(fā)表多篇關于黃藥子及黃獨乙素抗腫瘤作用的類似報道[15-17]，但不排除黃獨乙素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制存在其他方面的機制，需進一步研究。

當前臨床應用的一線化療藥物之間，或多或少存在著一定程度的交叉耐藥，當腫瘤對于某一種化療藥物產生耐藥后，其他化療藥物對該腫瘤所產生的抑制效果有一定程度的降低，尤其是相同作用機制的化療藥物[18]。以往國內外中藥的研究多針對其自身對腫瘤細胞的增殖抑制作用，而中藥對腫瘤細胞的耐藥細胞株的增殖抑制作用研究較少，近年來，國內外學者將目光轉向了中藥的輔助化療作用，比如有效抑制耐藥細胞增殖、逆轉多藥耐藥等研究方向[19]。黃獨乙素在本實驗中表現(xiàn)出對人胃癌SGC-7901細胞的低交叉耐藥性，人胃癌SGC-7901細胞對順鉑、5-FU、阿霉素產生耐藥并未影響黃獨乙素對其增殖抑制效果，這是傳統(tǒng)化療藥物難以克服的難題，也是化療失敗或者效果欠佳的主要原因，同樣也是當前研究所希望發(fā)現(xiàn)的中藥輔助化療的作用。黃獨乙素作為中藥單一成分所表現(xiàn)出來的這種低交叉耐藥性是未來研究中開發(fā)新型化療藥物應該重視的，也是未來中藥抗腫瘤研究的熱點。

[1]江蘇中醫(yī)學院. 中藥大辭典(下冊)[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1977: 2059-2061.

[2]YANG Ling. Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(1): 17-20.

[3]譚興起, 阮金蘭, 陳海生, 等. 黃藥子抗炎活性成分的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學學報, 2003, 24(6): 677-679.

[4]李國進. 黃藥子在治療亞急性甲狀腺炎中的作用[J]. 天津中醫(yī)藥, 2003, 20(2): 9.

[5]翟為民, 張力. 黃藥子的安全性評價與風險控制措施探討[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(17): 2355-2359.

[6]索晴, 崔立然, 劉樹民, 等. 黃藥子及配伍當歸后含藥血清抗腫瘤作用的研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技, 2008, 15(2): 113-114.

[7]喻澤蘭, 劉欣榮, MCCULLOCH M, 等. 黃藥子抗腫瘤活性組分篩選及作用分析[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(6): 563 -567.

[8]趙繼森, 程樹杰, 李鵬凱. 黃獨乙素抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖作用[J]. 醫(yī)學研究與教育, 2013, 30(3): 13-15.

[9]程櫻, 張立. 中藥抗腫瘤機制及藥物研究進展[J]. 中國藥業(yè), 2013, 22(17): 103-104.

[10]呂賀, 樸成國, 李香丹, 等. 中藥抗腫瘤機制的研究現(xiàn)狀[J]. 醫(yī)學綜述, 2011, 17(19): 3304-3306.

[11]李慶, 范曉磊. 中藥抗腫瘤的研究進展[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2007, 19(3): 317-318.

[12]廖美德, 梁世中. 中藥抗腫瘤機理的研究進展[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報, 2001, 23(4): 52-54.

[13]季秀海, 錢曉萍. 中藥有效成分抗腫瘤血管生成研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2010, 18(3): 594-597.

[14]李學濤, 譚靜凈, 喻榮平, 等. 中藥逆轉抗腫瘤藥物多藥耐藥性研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2013, 15(1): 155-158.

[15]李春峰, 邱軍強, 苗晶囡, 等. 黃藥子體外抗胃癌活性成分的篩選及分析[J]. 中成藥, 2014, 36(2): 387-390.

[16]李俊萱, 于海食, 宋雨婷, 等. 黃藥子的現(xiàn)代研究進展[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2013, 11(26): 52-55.

[17]趙許杰, 閆雪生, 孫丹丹. 黃藥子的藥理作用和臨床研究進展[J]. 藥物評價研究, 2012, 35(2): 147-149.

[18]陳云龍, 吳勉華. 中醫(yī)藥逆轉腫瘤多藥耐藥性研究現(xiàn)狀及局限性分析[J]. 山東中醫(yī)雜志, 2014, 33(3): 238-239.

[19]王潔茹, 張婷婷, 程曉東. 中藥抗卵巢癌侵襲轉移及化療耐藥的研究[J]. 實用肺瘤雜志, 2014, 29(1): 98-102.