siRNA靶向沉默Smad7對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪敏感性的影響

王一鳴 程 也 付丹陽(yáng) 王勇濤 王姣琦 梅春麗 莽 靖 徐忠信

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

腦缺血性損傷后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化并產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)功能〔1〕。激活素A(Act A)通過跨膜受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Smads活化觸發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧性損傷的保護(hù)作用〔2～4〕。在Smads家族中，Smad2/3為Act AⅠ型受體(ActRⅠ)的直接底物，磷酸化激活后與Smad4形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)〔5〕。Smad7通過與Smad2/3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷酸化的ActRⅠ，負(fù)性調(diào)控Act A/Smads通路活化〔6〕。本研究檢測(cè)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞對(duì)缺血缺氧性損傷的敏感性及Smad3基因mRNA的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù))。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)購(gòu)自Sigma公司，兔抗大鼠Smad7抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。Smad3、7及內(nèi)參GAPDH基因引物委托上海生工公司合成。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)與神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化 PC12細(xì)胞于含15%馬血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞接近80%融合時(shí)用0.25%胰酶消化傳代。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后加入 NGF(終濃度50 ng/ml)，連續(xù)刺激7 d誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化〔5〕。

1.3 氧糖剝奪模型的建立 應(yīng)用含10%胎牛血清和1.0 mmol/L Na2S2O4的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞〔5〕。計(jì)時(shí)16 h，建立 OGD 16 h 組。

1.4 siRNA的設(shè)計(jì)合成 利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索大鼠Smad7 序列(NM030858.1)，參考 Reynolds等〔7〕的 siRNA 設(shè)計(jì)原則及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)設(shè)計(jì)siRNA序列。該siRNA設(shè)計(jì)靶點(diǎn)起始于1 435 bp，靶基因序列1:5'-aacgaucugcgcucguccggcgu-3';正義鏈 5'-aacgaucugcgcucguccggcgudtdt-3';反 義 鏈 3'-dtdtuugcuagacgcgagcaggccgca-5'。靶向Smad7基因的siRNA、Cy5標(biāo)記的陽(yáng)性siRNA及陰性對(duì)照siRNA委托吉?jiǎng)P公司合成。

1.5 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及分組 使用Cy5標(biāo)記的陽(yáng)性siRNA(siRNA-T)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，以確定siRNA轉(zhuǎn)染效率及最佳轉(zhuǎn)染濃度。按說明書步驟操作，24孔板內(nèi)PC12細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。選擇4個(gè)濃度梯度 siRNA-T(20，30，50，100 nmol/L)，分別于轉(zhuǎn)染24 h后觀察。選取轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA濃度進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分別轉(zhuǎn)染靶向Smad7基因的siRNA，陰性siRNA及對(duì)照PBS，建立陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組，陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組。陽(yáng)性及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染24 h后OGD處理16 h。

1.6 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)Smad3、7 mRNA表達(dá) 收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用ABI7500Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)Smad3、7基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)?；蛞镆姳?。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Relative Quantification(ddCt)Study進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量(RQ)分析，并以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算Smad3、7 mRNA基因在不同組別之間的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.7 Western印跡檢測(cè)Smad7蛋白表達(dá) 收集陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗大鼠Smad7抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2 h，ECL顯影壓膠片。

1.8 4，6-二脒基-乙苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將3組細(xì)胞接種于預(yù)先放有爬片的24孔板，陽(yáng)性及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)OGD 16 h處理后收集細(xì)胞爬片進(jìn)行DAPI(100 ng/ml)染色，避光條件下37℃作用20 min后封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率觀察 轉(zhuǎn)染24 h后，隨著siRNA濃度升高轉(zhuǎn)染效率逐漸增加(均大于70%)。但siRNA 100 nmol/L組的轉(zhuǎn)染效率與50 nmol/L組無(wú)差別，故siRNA轉(zhuǎn)染的最佳濃度為50 nmol/L。見圖1。

2.2 Smad7 mRNA的表達(dá)檢測(cè) 與陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組Smad7 mRNA表達(dá)水平(0.32±0.13)比較，陰性轉(zhuǎn)染組(0.68±0.14)和空轉(zhuǎn)染組(0.73±0.11)明顯增高(P＜0.05)。

2.3 Smad7蛋白水平的表達(dá)檢測(cè) 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組Smad7蛋白表達(dá)水平(0.32±0.16)與陰性轉(zhuǎn)染組(0.99±0.12)及空轉(zhuǎn)染組(1.00±0.14)相比明顯降低(P＜0.05)，超過 67.0%(見圖2)。

圖1 陽(yáng)性siRNA(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染24 h后明暗場(chǎng)攝片

2.4 DAPI染色細(xì)胞凋亡檢測(cè) 靶向沉默Smad7聯(lián)合OGD 16 h組凋亡細(xì)胞比例(10.67%±0.25%)較陰性轉(zhuǎn)染聯(lián)合OGD 16 h 組(20.44%±0.87%)顯著減少(見圖3)。

2.5 Smad3 mRNA的表達(dá)檢測(cè) 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染聯(lián)合OGD 16 h組Smad3 mRNA表達(dá)水平(1.51±0.15)與陰性轉(zhuǎn)染聯(lián)合OGD 16 h組(0.90±0.13)相比明顯升高(P＜0.05)，陰性轉(zhuǎn)染聯(lián)合 DGD 16 h 組與空轉(zhuǎn)染組(0.53±0.18)比較有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 Smad7蛋白的表達(dá)檢測(cè)

圖3 靶向沉默Smad7細(xì)胞凋亡的變化(×400)

3 討論

Smad蛋白根據(jù)其在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用分為:通用Smad(Co-Smads)、抑制性Smads(ISmads)和膜受體激活的Smads(R-Smads)。目前已知的Co-Smad 僅有 Smad 4;R-Smads包括 Smad 1、2、3、5 和8;I-Smads包括Smad6和7，在TGF-β信號(hào)通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)功能〔8〕。在經(jīng)典研究中Smad7具有與R-Smads競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF-βⅠ型受體，促進(jìn) TGF-βⅠ型受體的去磷酸化和降解的功能〔6，8，9〕。

本研究說明抑制Smad7基因表達(dá)可降低OGD對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性。此外，Smad7基因沉默對(duì)PC12細(xì)胞缺血缺氧的保護(hù)作用是通過上調(diào)Act A通路下游主要位點(diǎn)Smad3基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

近期研究發(fā)現(xiàn)，作為I-Smad的一員，Smad6除了在胞質(zhì)中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控功能外，還在細(xì)胞核內(nèi)具有下調(diào)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的功能〔10〕。Zhang等〔11〕發(fā)現(xiàn) Smad7具有結(jié)合核內(nèi)DNA，干擾功能性Smads-DNA復(fù)合物形成，抑制TGF-β通路的功能。推測(cè)細(xì)胞核內(nèi)Smads-DNA復(fù)合物對(duì)Act A/Smads通路活化具有正反饋調(diào)節(jié)作用，沉默Smad7可能通過提高Smads-DNA功能進(jìn)而促進(jìn)Smad3轉(zhuǎn)錄。

1 Mukerji SS，Katsman EA，Wilber C，et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2007;27(6):1161.

2 Schmierer B，Hill CS.TGF beta-SMAD signal transduction:molecular specificity and functional flexibility〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2007;8(12):970.

3 He JT，Mang J，Mei CL，et al.Neuroprotective effects of exogenous activin A on oxygen-glucose deprivation in PC12 cells〔J〕.Molecules，2011;17(1):315-27.

4 Mang J，Mei CL，Wang JQ，et al.Endogenous protection derived from activin A/Smads transduction loop stimulated via ischemic injury in PC12 cells〔J〕.Molecules，2013;18(10):12977-86.

5 Wang JQ，He JT，Du ZW，et al.Effects of SARA on oxygen-glucose deprivation in PC12 cell line〔J〕.Neurochem Res，2013;38(5):961-71.

6 Shi W，Sun C，He B，et al.GADD34-PP1c recruited by Smad7 dephosphorylates TGFbeta type Ⅰ receptor〔J〕.J Cell Biol，2004;164(2):291-300.

7 Reynolds A，Leake D，Boese Q，et al.Rational siRNA design for RNA interference〔J〕.Nature Biotechnol，2004;22(3):326-30.

8 Kato S，Ueda S，Tamaki K，et al.Ectopic expression of Smad7 inhibits transforming growth factor responses in vascular smooth muscle cells〔J〕.Life Sci，2001;69(22):2641-52.

9 Ebisawa T，F(xiàn)ukuchi M，Murakami G，et al.Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta typeⅠreceptor through Smad7 and induces receptor degradation〔J〕.J Biol Chem，2001;276:12477-80.

10 Jung SM，Lee JH，Park J，et al.Smad6 inhibits non-canonical TGF-β1 signalling by recruiting the deubiquitinase A20 to TRAF6〔J〕.Nat Commun，2013;4:2562.

11 Zhang S，F(xiàn)ei T，Zhang L，et al.Smad7 antagonizes TGF-β signaling in the nucleus by interfering with functional Smad-DNA complex formation〔J〕.MCB，2007;27(12):4488-99.