HPLC法測定人血漿中拉莫三嗪的濃度及其影響因素研究

宋霞，張建隆，邱雯（1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，蘭州730030；.天水市第一人民醫(yī)院藥劑科，甘肅天水 741000）

癲癇是腦部神經元突發(fā)性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種常見的神經系統(tǒng)慢性發(fā)作性疾病。藥物治療是治療癲癇的首選方法，對大約70%的癲癇患者治療有效。但傳統(tǒng)抗癲癇藥（如丙戊酸鈉、卡馬西平、苯巴比妥、苯妥英鈉、撲癇酮、乙琥胺）耐受性問題嚴重，不良反應較多，因而近十幾年來已有不少新型抗癲癇藥問世。拉莫三嗪（Lamotrigine，LTG）是一種新型抗癲癇藥，是封閉電壓應用依從性的鈉離子高通道阻滯藥，主要通過抑制神經元釋放病理性谷氨酸遞質而發(fā)揮抗癲癇（EP）作用，具有廣泛的抗癲癇譜，對多種類型的發(fā)作均有效。由于LTG適用人群廣、藥動學個體差異大，有必要對LTG用藥患者進行治療藥物監(jiān)測，以促進LTG合理應用及個體化用藥方案的調整。本文建立了HPLC法測定LTG血藥濃度，并收集我院癲癇患者LTG治療藥物監(jiān)測情況進行相關分析。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，包括G1315 A型二元泵、G1315 B型二極管陣列檢測器、G2170 AA型色譜工作站（美國安捷倫公司）；GENIUS電子天平（德國賽多利斯集團）；TGL-16 GB小型通用離心機（上海安亭科學儀器廠制造）。

1.2 藥品與試劑

拉莫三嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100775-200401）；內標：氯霉素對照品（上海申藥股份有限公司，批號：941203）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100142-199503）；苯妥英鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100210-200401）；苯巴比妥（PB）對照品（國家麻醉品實驗室，批號：1222-9602）；地西泮對照品（國家麻醉品實驗室，批號：1230-9601）；氯硝西泮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：1227-9701）。對照品均為含量測定用。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 資料來源

2012年7月－2013年6月在我院癲癇中心、神經內科、神經外科診治并進行LTG治療藥物監(jiān)測的患者320例次，收集患者性別、年齡、體質量、LTG維持劑量、末次服藥時間、取血時間、合并用藥的藥物和劑量等信息。

2 方法與結果

2.1 HPLC含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件：色譜柱為Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/l磷酸二氫鉀，1 mol/L氫氧化鈉調節(jié)pH至6.0，30∶70，V/V）；流速為1.0 ml/min；進樣量為20 μl；柱溫為30℃；檢測波長為306 nm。在該色譜條件下，拉莫三嗪與氯霉素的保留時間分別為7.48、11.73 min，色譜見圖1。

圖1 對照品高效液相色譜圖1.拉莫三嗪；2.氯霉素Fig 1 HPLC chromatograms of standard control1.lamotrigine；2.chloramphenicol

2.1.2 標準溶液的配制：準確稱取LTG對照品10.8 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.08 mg/ml LTG儲備液。將LTG儲備液用甲醇稀釋，配制質量濃度分別為4.0、8.0、16.0、40.0、64.0、80.0、96.0、128.0、160.0μg/ml的 LTG 標準溶液，將儲備液與標準溶液于4℃下保存。

2.1.3 內標溶液的配制：準確稱取氯霉素對照品10.0mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得100 μg/ml的內標溶液，于4℃下保存。

2.1.4 血漿樣品的處理及測定：精密吸取血漿樣品200 μl，置1.5ml離心管中，加入甲醇25μl及內標溶液25μl，渦旋混勻30 s后加入300 μl甲醇沉淀，渦旋混勻1 min，以離心半徑為8 cm、10000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾，取濾液20 μl進樣。

2.1.5 專屬性考察：取空白血漿200 μl，按“2.1.4”項下方法操作，取上清液20 μl進樣分析，得到空白血漿色譜圖2 A。將空白血漿和拉莫三嗪與氯霉素對照品混合，按“2.1.4”項下方法操作，取上清液20 μl進樣分析，得到樣品溶液色譜圖2 B。如圖2所示，在該色譜條件下，血漿中的內源性物質對拉莫三嗪的測定無影響。

2.1.6 線性關系考察：精密吸取空白血漿200μl共9份，置于1.5 ml離心管中，分別加入不同質量濃度的LTG標準溶液25 μl及內標溶液25 μl，渦旋混勻30 s，使LTG血藥濃度分別相當于0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0μg/ml。分別加入甲醇300 μl沉淀，渦旋混勻1 min，以離心半徑8 cm、10000 r/min離心10min，取上清液經0.22μm濾膜濾過，取濾液20μl進樣測定，記錄色譜。以LTG系列溶液的峰面積（As）和內標峰面積（Ai）之比（y）為縱坐標、LTG質量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：y＝0.1736 x+0.0147（r＝0.9995，n＝9）。結果表明，LTG血藥濃度在0.5～20 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.1.7 回收率與精密度試驗：分別于200μl空白血漿中加入低、中、高3種質量濃度的LTG標準溶液20 μl，渦旋混勻30 s，使血藥濃度分別相當于1.0、10.0、20.0 μg/ml，按“2.1.4”項下方法處理并測定。以LTG血藥濃度測得量與加入量之比計算方法回收率。以同日內測得的LTG濃度計算日內精密度，以1周內6次測定的LTG濃度計算日間精密度，詳見表1。

表1 回收率與精密度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

表1 回收率與精密度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

加入量，μg/ml 1.010.020.0測得量，μg/ml 0.94399.657318.3626回收率，%94.39±1.5795.57±2.2291.81±2.11日內R SD，%1.662.301.15日間R SD，%2.162.422.34

2.1.8 重復性試驗：按“2.1.4”項樣品制備方法制備同濃度樣品8份，按并依法測定LTG濃度。結果，樣品中LTG平均含量的RSD為1.89%，表明該法重復性良好。

2.1.9 干擾性試驗：取臨床常用的抗癲癇藥卡馬西平、PB、苯妥英鈉、地西泮、氯硝西泮對照品適量，分別配制10.0 μg/ml的供試溶液，同時將上述所有對照品溶液與拉莫三嗪混合，按“2.1.1”項下色譜條件進樣。結果表明，卡馬西平、PB、苯妥英鈉、地西泮、氯硝西泮對拉莫三嗪的測定均不產生干擾。另外，丙戊酸（VPA）分子結構中缺乏特征的紫外光譜吸收，用高效液相色譜法不能直接測定，因此，在本試驗條件下，VPA對拉莫三嗪的測定無影響。

2.2 LTG血藥濃度相關結果分析

2.2.1 樣品采集：測定穩(wěn)態(tài)時LTG的血藥谷濃度?；颊哂谙乱淮畏幥俺槿∪?～3 ml，置于普通采血管中，以離心半徑為8 cm、4000 r/min于室溫離心10 min，于－20℃冰箱保存待測。

2.2.2 分組及統(tǒng)計方法：將搜集的320例病例，按照LTG單用及聯用分為3組：單用LTG組、LTG+VPA組、LTG+PB組，依次定義為1、2、3組。結果采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。應用逐步回歸分析法評價分析影響LTG血藥濃度的各類因素；用相關分析論證LTG與VPA以及PB之間的相互作用。

2.2.3 人群分布特征：2012年7月－2013年6月我院LTG血藥濃度監(jiān)測患者總人數為320例。其中男性158例，女性162例，男女性別比例為0.98∶1；17～45歲患者中女性居多，1～16歲患者中男性所占比例大。從患者年齡看，1～16歲患者占52.5%，兒童為我院LTG血藥濃度監(jiān)測患者中所占比例最大的人群；17～45歲青壯年患者占35.31%，屬于第二主體人群；46～75歲中老年患者所占比例最小，見表2。

表2 監(jiān)測患者人群性別與年齡分布（例）Tab 2 Population sex and age distribution of monitored patients（case）

2.2.4 LTG血藥濃度的影響因素：整理320例血漿樣本中LTG的含量及其可能的相關因素：性別、年齡、體質量、LTG給藥劑量（mg/kg）、治療組類別（1組：LTG單藥治療組；2組：LTG+VPA聯合治療組；3組：LTG+PB聯合治療組）輸入統(tǒng)計學軟件以通過逐步回歸分析法逐步剔除或篩選影響LTG血藥濃度的因素（檢驗水平為0.05）。結果顯示，LTG給藥劑量、聯用VPA、聯用PB可顯著影響LTG血藥濃度（P＜0.05），性別、年齡、體質量則與其不存在顯著性的相關關系（P＞0.05）（見表3）。將影響因素LTG給藥劑量、聯用VPA、聯用PB分別設定為自變量x1、x2、x3，LTG血藥濃度設為因變量y，得逐步回歸方程為：y＝0.6417 x1+2.5698 x2－2.0482 x3－0.2078；經方差分析，P＜0.01。由此方程可知，LTG血藥濃度與LTG給藥劑量、VPA的影響呈正相關，與PB的影響呈負相關。即增大LTG給藥劑量或加用VPA可提高LTG的血漿水平，加用PB則能降低其血漿水平。

2.2.5 聯合應用其他抗癲癇藥對LTG血藥濃度的影響：各組一般資料及藥物劑量與血藥濃度比較見表4。2組VPA劑量范圍為1.85～58.33mg/（kg·d）；3組PB劑量范圍為1.19～5.29mg/（kg·d）。其中PB聯合治療組的拉莫三嗪血藥濃度[（0.8±0.92）μg/ml]＜LTG單藥治療組[（3.02±2.55）μg/ml]＜VPA聯合治療組[（5.37±3.47）μg/ml]。應用方差分析法比較3組血藥濃度，得到F值為0.0190，P＜0.01，表明各治療組間拉莫三嗪的血藥濃度存在著極顯著的差異。

表3 影響LTG血藥濃度的因素分析（n＝320）Tab 3 Analysis of influential factors of plasma concentration of LTG（n＝320）

表4 血漿樣本中拉莫三嗪的血藥濃度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

表4 血漿樣本中拉莫三嗪的血藥濃度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

組別1組2組3組例數14915813平均年齡，歲23.32±17.0819.73±15.957.85±5.27平均體質量，k g 47.1±18.1646.3±20.2123.81±10.98 LT G平均維持劑量，mg/（k g·d）3.27±1.973.03±1.653.66±2.06 LT G平均血藥濃度，μg/ml 3.02±2.555.37±3.470.8±0.92

2.3 不同組別中藥物因素與LTG血藥濃度的相關性分析

2.3.1 LTG單藥治療組：LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性：采用Pearson相關分析，對LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析。結果表明，r＝0.119，P＞0.01。散點圖顯示，LTG血藥濃度隨著劑量的增加有上升趨勢，但無統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3 LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性散點圖Fig 3 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

2.3.2 LTG與VPA聯合治療組：（1）LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性。對LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析，結果r＝0.536，P＜0.01，表明LTG血藥濃度與LTG給藥劑量具有顯著的正相關關系。散點圖顯示，LTG血藥濃度隨著LTG給藥劑量的增加而增加，見圖4。（2）VPA給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性。對VPA給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析，結果r＝0.112，P＞0.01。散點圖顯示，LTG血藥濃度隨著VPA劑量的增加有上升趨勢，無統(tǒng)計學意義，見圖5。（3）VPA血藥濃度與LTG血藥濃度的相關性。對VPA血藥濃度與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析，結果r＝0.206，P＜0.01，表明LTG血藥濃度與VPA血藥濃度具有顯著的正相關關系。散點圖顯示，LTG血藥濃度隨著丙戊酸血藥濃度的上升而上升，見圖6。

圖4 LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性散點圖Fig 4 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

圖5 VPA給藥劑量與LTG血藥濃度的相關性散點圖Fig 5 The scatter diagram of VPA dose and LTG plasma concentration

圖6 VPA血藥濃度與LTG血藥濃度的相關性散點圖Fig 6 The scatter diagram of VPA plasma concentration and LTG plasma concentration

2.3.3 LTG與PB聯合治療組：對LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析，結果r＝0.320，P＞0.01。對PB給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關系進行分析，結果r＝0.040，P＞0.01。兩種結果差異均無統(tǒng)計學意義。由于此組別中進行苯巴比妥血藥濃度測定的樣本較少，故不便進行PB血藥濃度與LTG濃度的Parson相關分析。

3 討論[1-6]

3.1 影響LTG血藥濃度的因素

LTG屬于苯基三嗪類化合物，是一種新型抗癲癇藥，具有弱的抗葉酸活性。鑒于其良好的抗癲癇作用，可用于各種癲癇的治療，也可單用或聯合添加使用。近年來，國外也有資料報道顯示LTG單藥治療部分性發(fā)作為主的成人及兒童癲患者也有較好的效果[1-2]。

本文特選取320例采用LTG治療的癲癇患者，通過逐步回歸分析法依次剔除或篩選影響LTG血藥濃度的因素，結果顯示LTG給藥劑量、聯合應用VPA或PB對LTG血藥濃度影響具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從作用大小來看，聯合應用VPA對LTG血藥濃度的影響最為明顯，其次為LTG給藥劑量。從作用性質來看，LTG血藥濃度與LTG給藥劑量、VPA的影響呈正相關，與PB的影響呈負相關，即增大LTG給藥劑量或者聯合應用VPA可提高LTG血漿水平，而加用PB則可降低LTG的血漿水平?；诖?，LTG的臨床治療不能僅僅通過給藥劑量而了解其血藥濃度。為了更好地實現個體化給藥，為患者制訂安全、合理、有效的治療方案，建立該藥的血藥濃度監(jiān)測工作必不可少。此外，體質量對LTG血藥濃度的影響在國外文獻亦有報道，研究指出由于高體質量患者體內LTG的清除速率較慢因而血漿水平較高[3]。本文研究未出現此結果。

3.2 聯合用藥對LTG血藥濃度的影響

VPA與LTG聯合應用是目前臨床治療難治性癲癇的主要方法。在藥效學方面，LTG可增強γ-氨基丁酸（GABA）能突觸后作用，VPA抑制興奮性氨基酸釋放，共同使膜電位趨于穩(wěn)定，兩藥抗癲癇機制互補。在藥動學方面，90%的LTG主要通過與葡萄糖醛酸結合代謝，大約30%～50%的VPA也經葡萄糖醛酸結合代謝，VPA可競爭性抑制LTG與葡萄糖醛酸的結合，使LTG清除率下降，從而延長LTG的半衰期，提高LTG的血漿水平。Gidal BE等[4]在一項研究中發(fā)現，丙戊酸的血藥濃度在治療水平（50～120μg/ml）便顯著抑制LTG的清除率，VPA濃度超過20 μg/ml時對LTG的口服清除率的抑制程度最大。Paraskevas GP等[5]研究表明VPA與LTG合用臨床療效顯著，且血漿內谷氨酸含量明顯降低，其效果優(yōu)于LTG單藥治療。

LTG在與具有肝酶誘導作用的藥物如PB、卡馬西平、苯妥英鈉合用時，其藥動學可發(fā)生改變，半衰期縮短。臨床上聯合使用時，通常需要增加LTG的劑量[6]。本研究通過逐步回歸分析發(fā)現聯合應用其他抗癲癇藥是影響LTG血藥濃度的重要因素（P＜0.05）。LTG單藥治療組與2個聯合用藥組做F值檢驗，顯示3組LTG血藥濃度有顯著差異（P＜0.01）。VPA治療組的LTG平均血藥濃度最高，LTG單藥治療組次之，PB治療組最低，表明加用PB可顯著降低LTG血藥濃度，加用VPA則能顯著升高其血藥濃度。

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