心肌肥厚模型建立方法的研究進展

趙祎鐳，李丹露（哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，哈爾濱 150001）

心肌肥厚過程中伴隨著心臟結構和功能的改變，其病理變化以室間隔與室后壁中部肥厚最常見，也稱之為非對稱性肥厚?；颊唛L期處于此病理狀態(tài)可導致心力衰竭甚至猝死[1-2]。心肌肥厚在普通人群中的發(fā)病率是0.2%，男女性別比例為2∶1，患者的平均年齡為40歲左右，是40歲以下患者主要的死亡原因之一[3]。因此，預防并及時治療心肌肥厚成為人們日益關心和逐漸深入研究的熱點。

為了進一步明確心肌肥厚的發(fā)病機制和作用途徑，國內外的研究學者分析各種心肌肥厚患者的發(fā)病原因，不斷建立和驗證不同的心肌肥厚模型。目前，關于模型的研究領域主要集中在從動物和心肌細胞水平模擬心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程。通過適宜的心肌肥厚模型，評價不同藥物的治療效果，可為臨床上治療心肌肥厚奠定基礎。因此，筆者以“心肌肥厚”等為關鍵詞，查閱1991年1月至2013年3月中國知網和PubMed數(shù)據(jù)庫中關于心肌肥厚模型的相關文獻，首次歸納總結了目前廣泛采用的建立心肌肥厚模型的方法，同時分析了不同建模方法的特點，不僅為試驗中適宜建模方法的選擇與評價奠定了基礎，還為藥物干預肥厚疾病的基礎研究提供了科學的建模依據(jù)。

1 導致心肌肥厚的因素[4-5]

主要因素是機械刺激導致心肌肥厚。血流動力學超負荷，壓力/容量超負荷均造成心室壁張力增加，從而引起心肌細胞肥大[6]。同時血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可以通過血管緊張素受體1（AT1）使信號轉導激活因子（STAT3）活化，參與調節(jié)核中轉錄因子的表達，從而刺激心肌細胞肥大[7]。兒茶酚胺類物質中異丙腎上腺素（ISO）和去甲腎上腺素（NA）能夠分別激動β受體和α1腎上腺能受體，導致促進原癌基因表達和心肌細胞肥大。研究表明，內皮素1（ET-1）可以通過激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）誘導心肌細胞肥大；前列腺F2α（PGF2α）也能啟動下游蛋白激酶C（PKC）與肌醇三磷酸（IP3）信號分子，促進心肌細胞肥大的發(fā)生[8]。此外，缺血、缺氧以及各種炎癥因子均可導致心肌細胞的應激反應，從而導致心肌肥厚。

2 建立體外、體內心肌肥厚模型的方法

目前的肥厚模型主要分成兩種：一種是通過動物模型模擬穩(wěn)定的代償性肥厚發(fā)展到心肌功能衰竭和心室擴張的過程；另一種是在細胞水平模擬肥大過程，以此明確人類心肌肥厚的調控機制，為更好地緩解或治療心肌肥厚奠定基礎。

2.1 誘導心肌細胞肥大的方法

目前，體外建立心肌細胞肥大的模型多數(shù)是通過分離并培養(yǎng)Wistar/SD大鼠的乳鼠心室肌細胞，在此基礎上給予不同藥物刺激達到誘導細胞肥大的目的。例如，通過ISO誘導心肌細胞48 h，顯微鏡下觀察心肌細胞外觀狀態(tài)改變，主要表現(xiàn)在心肌細胞面積明顯增加，心房利鈉肽（ANP）、腦利鈉肽（BNP）、β-肌球蛋白（β-MHC）等肥大相關基因的表達增加，其變化趨勢與肥厚心臟組織中的改變類似[9-10]。此外苯丙腎上腺素（PE）和AngⅡ都可以刺激心肌細胞增大，模擬誘導心肌細胞肥大[11-13]。Pan ZW等[14]采用50 μmol/L PE孵育心肌細胞48 h后，經免疫熒光觀察與統(tǒng)計學分析，肥大細胞面積增加至對照組的1.3倍。Wang S等[15]證明0.1 μmol/LAngⅡ能夠誘導心肌細胞肥大，主要的肥厚Marker蛋白表達顯著增加。上述試驗證明，細胞水平上給予ISO、PE和AngⅡ均能誘導心肌細胞肥大，此方法具有細胞專屬性，能夠排除成纖維細胞的影響，成功地模擬心肌細胞的肥大過程。

2.2 動物心肌肥厚模型的建立方法

盡管體外可以模擬心肌肥大過程，但是細胞水平不能完全替代動物水平研究，不是所有的體外試驗結論在活體動物中都能得到重復驗證。因此，許多研究者開始探索建立動物心肌肥厚模型。根據(jù)導致心肌肥厚的不同誘因，目前建立動物心肌肥厚模型的方法有兩種：第一種是皮下或靜脈注射腎上腺素類藥物；第二種是通過手術建立心肌肥厚模型。

2.2.1 藥物誘導。該方法主要是采取每天注射ISO、AngⅡ、PE等腎上腺素藥物的方式。胡河等[16]通過對新西蘭大耳兔的耳緣靜脈連續(xù)注射0.3 mg/（kg·d）的ISO 7 d，解剖心臟后測得大耳兔左心室質量和心室壁厚度明顯增加，結果表明心肌肥厚模型成功建立。但是這種給藥方式存在局限性，即不能完全地模擬生理分泌腎上腺素的過程。在試驗操作過程中，劑量過大可能導致動物的死亡，劑量過小則不能成功地建立肥厚模型。為了提高實驗動物的生存率，以及盡可能模擬體內病理過程，如今多選擇皮下埋泵方式，即藥物通過緩釋泵平穩(wěn)注入動物體內。此方法不僅提高動物的成模率[13]，還降低了動物死亡率[17-18]。Takeshita D等[19]利用埋泵給藥的方式考察不同劑量的ISO對心肌肥厚的影響。Sun B等[20]皮下埋泵給予AngⅡ，7 d后建立病理性心肌肥厚，肥厚組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）的蛋白表達量顯著增加，研究表明BMP4的異常表達易導致心肌細胞凋亡、間質纖維化等現(xiàn)象。此外，AngⅡ[1.4 mg/（kg·d），皮下埋泵]連續(xù)給藥8周，能使C57BL/6J和Balb/c小鼠的心臟、肺臟以及肝臟質量明顯增加，并伴隨著間質纖維化，其中Balb/c小鼠表現(xiàn)為擴張型心肌病[21]。綜上認為，藥物誘導動物心肌肥厚的模型具有操作簡單的優(yōu)勢，能夠模擬腎上腺素分泌量增加導致心肌肥厚的病理過程。

2.2.2 手術建立。隨著壓力負荷的不斷增加，高血壓和主動脈狹窄的患者出現(xiàn)心肌肥厚現(xiàn)象[10]。模擬上述情況建立了手術模型，其中胸主動脈縮窄法的使用率較高，這種方法能夠模擬血管狹窄導致的血壓升高，以及血壓長期升高引起的心室壁厚度的增加[22-24]。胸主動脈縮窄法的操作步驟如下：對實驗動物實施腹腔麻醉，氣管插管后聯(lián)通呼吸機；隨后沿胸骨中線開胸并剝離暴露出胸主動脈，將26 Gauge針頭平行于主動脈弓放置，選擇7～0號線進行結扎；最后抽出針頭，逐層縫合胸骨與皮膚，術后肌肉注射2 d青霉素鈉預防感染。大量研究表明，小鼠經胸主動脈結扎縮窄2～4周后，小鼠心臟質量明顯增加，經蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌細胞面積明顯增加，在mRNA和蛋白水平上都能檢測到ANP、BNP、β-MHC等肥厚Marker指標的表達增加[25-26]。胸主動脈縮窄法能夠模擬心肌肥厚，當小鼠動脈結扎超過8周，心臟射血分數(shù)將顯著降低，呈現(xiàn)心力衰竭的狀態(tài)。

除了結扎胸主動脈，國內外研究人員還采用腹主動脈縮窄法建立心肌肥厚模型。該方法需要翻轉并移動腹腔內臟器官，暴露腹主動脈，手術具有一定難度。與胸主動脈縮窄法比較，雖然可以降低開胸操作造成的損傷，但是此手術對動物內臟腸胃的牽拉較強，某種程度上影響了建模的成功率。術后2周，大鼠體質量明顯增加，壓力測定顯示心率和壓力顯著升高（P＜0.01）。通過病理學觀察，大鼠結扎4周后細胞核變大、細胞排列混亂，呈現(xiàn)肥大狀態(tài)[27-28]。研究表明，縮窄血管的方法主要是經過緩慢的病理變化模擬心肌肥厚，更接近肥厚疾病的真實病理進程。

此外，結扎腎動脈血管也可以造成血壓的升高，模擬由腎性高血壓誘發(fā)的心肌肥厚過程[12]。根據(jù)臨床上容量超負荷引起心肌肥厚的原理，對大鼠動靜脈進行造瘺，造瘺后由于動脈血流入下腔靜脈，使得心臟回心血量增加，進而心臟容量負荷增加，最終導致心肌肥厚。手術操作主要是用血管夾阻斷下腔靜脈的血流，然后用針頭刺穿靜脈壁、靜-動脈聯(lián)合壁，退出針頭后縫合靜脈壁的傷口，松開血管夾，下腔靜脈變紅則表明造瘺成功。

3 各種肥厚模型建立方法的比較

大量試驗證明，體外、體內均能成功地建立心肌肥厚模型。上述心肌肥厚模型分別存在著優(yōu)點和局限性，其中動物水平模型可以通過增加壓力負荷刺激心室壁增厚，并且伴隨著心臟功能的改變；而細胞水平肥大模型是以心肌細胞為載體研究肥厚的作用機制以及藥物干預細胞肥大的調控通路。心肌肥厚模型建立方法的特點分析見圖1。

綜上認為，需要根據(jù)試驗研究的不同側重點，選擇適宜的建模方法。

4 心肌肥厚模型建立方法的評價

針對不同的建立心肌肥厚模型的方法，通常選擇適宜的指標進行評價。目前，廣泛認可的評價指標包括：觀察動物心臟、左心室質量的變化情況，計算不同建模方法的質量指數(shù)；心臟超聲檢查分析心臟結構的改變情況；通過免疫染色分析細胞面積的改變；測定心肌肥厚過程中Marker基因的mRNA及蛋白水平的變化。評價的具體方法如下。

4.1 全心質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)

圖1 心肌肥厚模型建立方法的特點分析

在動物心肌肥厚模型中，隨著建模時間的延長，動物心臟的質量會逐漸增加，而且以左心室質量的變化為主。通常以動物的全心質量指數(shù)（Heart weight/body weight，HW/BW）和左心室質量指數(shù)（Left ventricular weight/heart weight，LVW/HW）作為標準評價心肌肥厚模型。根據(jù)建立心肌肥厚模型的不同方法，全心質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)的平均增加比例在15%～40%[24-26]。

4.2 心臟超聲檢查

評價動物心肌肥厚模型時，需要對各組的心臟功能及形態(tài)結構進行心臟彩超檢查。分別測定小鼠的心率、射血分數(shù)、短軸收縮分數(shù)、左室后壁厚度、室間隔期厚度的變化。如果模型動物的心室后壁、室間隔厚度明顯增加，則證明此方法能夠成功地建立肥厚模型。

4.3 免疫組化分析

選取典型的心臟置于多聚甲醛中固定，組織切片經蘇木精和HE染色觀察各組細胞面積與排列的變化。結果表明，HE染色后觀察到細胞面積明顯增加、排列紊亂，表明建模方法適宜。

4.4 心肌肥厚Marker蛋白的分析

ANP是一種參與調節(jié)血壓的肽類激素，具有強大的利尿活性。BNP主要來源于心室，其結構與功能與ANP類似。當心室壓力明顯增加時，可以檢測到血漿中BNP也顯著升高。目前許多國家都推薦使用BNP作為評價心血管疾病的重要檢測指標之一[29-31]。另有研究表明，β-MHC基因的表達參與心臟發(fā)育、壓力負荷、心肌肥厚等過程，在左心室壓力增加的時候，能夠刺激β-MHC基因再次表達[32-33]。目前，ANP、BNP和β-MHC是公認的心肌肥厚過程中的Marker蛋白，因此可依據(jù)上述3種基因在mRNA或者蛋白水平的改變來評價心肌肥厚模型的建立效果。

5 結語

根據(jù)目前國內外的文獻報道，本文總結了建立心肌肥厚模型的方法，即胸/腹主動脈縮窄法、靜脈造瘺法、皮下注射腎上腺素能藥物、藥物誘導心肌細胞等方法。其中主動脈縮窄建立肥厚模型的方法能夠模擬臨床上動脈瓣狹窄及腎性高血壓患者伴隨的心肌肥厚疾病，而體外ISO等藥物誘導細胞肥大的模型則是模擬體內腎上腺素類物質異常分泌引起的心肌肥厚。上述建模方法都是經典的且被國內外研究者廣泛認可的。研究表明，只有接近臨床肥厚患者實際患病過程的模型，才具有更高的研究價值，在此基礎上才能深入發(fā)現(xiàn)心肌肥厚疾病的發(fā)生發(fā)展機制，最終為減少和改善心肌肥厚及相關治療藥物的研發(fā)和應用奠定科學的理論基礎。

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