HPLC法測(cè)定膽酸類(lèi)化合物與牛血清白蛋白的結(jié)合率Δ

張曉靜，李丹丹，張俊義，孫毅坤（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京0002；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京0002）

膽汁酸在脂類(lèi)物質(zhì)的消化吸收和膽固醇代謝方面發(fā)揮著重要作用，膽酸（CA）作為人體膽汁中含量最豐富的膽汁酸，主要用作利膽藥，因可治療膽囊炎、膽汁缺乏、腸道消化不良等癥而被廣泛使用[1-2]。目前市場(chǎng)上已有膽酸鈉片、豬脫氧膽酸（HDCA）片等膽酸類(lèi)藥物。藥物作用的強(qiáng)弱與作用部位的藥物濃度密切相關(guān)，當(dāng)藥物在體內(nèi)各組織分布趨于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，組織內(nèi)藥物化學(xué)勢(shì)趨于一致，其轉(zhuǎn)運(yùn)速率遵循一定的規(guī)律。然而，血液中的藥物有相當(dāng)一部分可與蛋白結(jié)合，而結(jié)合形態(tài)的藥物不能夠參加轉(zhuǎn)運(yùn)并發(fā)揮藥理作用；但結(jié)合態(tài)藥物與游離態(tài)藥物之間存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，隨著藥物在體內(nèi)代謝、排泄或組織內(nèi)蓄積，與蛋白結(jié)合的藥物可解離為游離態(tài)藥物，在一定程度上達(dá)到維持血藥濃度的作用[3-4]。因此，藥物與蛋白的結(jié)合作用對(duì)于藥物體內(nèi)過(guò)程的研究有著重要的意義。近年來(lái)有關(guān)膽酸類(lèi)化合物研究的文獻(xiàn)報(bào)道很多[5-7]，但是針對(duì)膽酸類(lèi)化合物與蛋白之間的相互作用卻鮮有研究，而了解二者的相互作用有助于從分子水平上進(jìn)一步了解膽酸類(lèi)化合物體內(nèi)蛋白結(jié)合特性，從而有助于設(shè)計(jì)和改造膽酸類(lèi)藥物分子以提高藥效和安全性，縮短作用時(shí)間，進(jìn)而為膽酸類(lèi)化合物的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、藥理學(xué)以及毒理學(xué)方面提供重要依據(jù)和參考。本試驗(yàn)采用平衡透析法研究了膽酸類(lèi)化合物與牛血清白蛋白（BSA）的結(jié)合率，為進(jìn)一步開(kāi)展膽酸類(lèi)的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Alltech3300-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（ELSD）器（北京先明樂(lè)施科技發(fā)展有限公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VORTEX GENIVS 3旋渦混勻儀[萊貝（上海）科學(xué)儀器有限公司]；MTN-2800D型氮?dú)獯蹈蓛x（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；pHS-W型精密pH計(jì)（上海般特儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

膽酸對(duì)照品、豬脫氧膽酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100078-200414、100087-200610，均為含量測(cè)定用）；BSA標(biāo)準(zhǔn)品（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C020102，純度：98%）；透析袋（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品貯備液：分別精密稱(chēng)取膽酸對(duì)照品、豬脫氧膽酸對(duì)照品適量，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得膽酸、豬脫氧膽酸的對(duì)照品貯備液，備用。

2.1.2 BSA溶液：取BSA標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱(chēng)定，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1 mmol/L的BSA溶液。

2.1.3 透析液：取磷酸二氫鉀2.72 g、氯化鈉8.8 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液適量，調(diào)節(jié)pH至7.4，補(bǔ)水至1000 ml，即得濃度為0.02 mol/L的PBS（內(nèi)含0.15 mol/L氯化鈉），作為透析液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸溶液（80∶20），流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：15 μl；ELSD檢測(cè)器；漂移管溫度：80℃；氣體流速：2.0 L/min。分別進(jìn)樣膽酸的PBS溶液、膽酸的BSA溶液、透析袋內(nèi)膽酸樣品溶液、透析袋外膽酸樣品溶液、豬脫氧膽酸的PBS溶液、豬脫氧膽酸的BSA溶液、透析袋內(nèi)豬脫氧膽酸樣品溶液、透析袋外豬脫氧膽酸樣品溶液和透析液，記錄色譜，見(jiàn)圖1。

圖1 膽酸類(lèi)化合物的HPLC圖A.膽酸的PBS溶液；B.膽酸的BSA溶液；C.透析袋內(nèi)膽酸樣品溶液；D.透析袋外膽酸樣品溶液；E.豬脫氧膽酸的PBS溶液；F.豬脫氧膽酸的BSA溶液；G.透析袋內(nèi)豬脫氧膽酸樣品溶液；H.透析袋外豬脫氧膽酸樣品溶液；I.透析液；1.膽酸；2.豬脫氧膽酸Fig 1 HPLC chromatograms of cholic acid compoundsA.PBS solution of CA；B.BSA solution of CA；C.sample solution of CA in dialysis bag；D.sample solution of CA out of dialysis bag；E.PBS solution of HDCA；F.BSA solution of HDCA；G.sample solution of HDCA in dialysis bag；H.sample solution of HDCA out of dialysis bag；I.dialysate；1.CA；2.HDCA

由圖1可知，本試驗(yàn)中膽酸、豬脫氧膽酸的PBS溶液及BSA溶液的色譜圖峰形良好，無(wú)雜質(zhì)干擾測(cè)定，具有較高的特異性，分析條件可行。

2.3 樣品處理

取樣品溶液200 μl，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液50 μl，加甲醇1 ml沉淀蛋白，旋渦混合30 s，以12000 r/min（離心半徑：8 cm）離心5 min，取上清液500 μl置于另一干燥聚乙烯塑料（PE）管中，氮?dú)獯蹈桑?00 μl甲醇復(fù)溶，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

2.4.1 膽酸、豬脫氧膽酸在BSA溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線：取膽酸對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋成0.26、0.52、1.03、2.05、4.1 mg/ml系列對(duì)照品溶液；另取豬脫氧膽酸對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋成0.30、0.59、1.18、2.36、4.72 mg/ml系列對(duì)照品溶液；再分別取200 μl BSA溶液各5份，分別加入上述不同質(zhì)量濃度的膽酸、豬脫氧膽酸系列對(duì)照品溶液各100 μl，分別配成相當(dāng)于含0.029、0.058、0.116、0.232、0.464 mg/ml膽酸及 0.019、0.039、0.078、0.156、0.311 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：膽酸y＝0.9862x+3.8111（r＝0.9997），豬脫氧膽酸y＝1.0806x+4.0587（r＝0.9997）。結(jié)果二者檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為：膽酸0.029～0.464 mg/ml、豬脫氧膽酸0.019～0.311 mg/ml。

2.4.2 膽酸、豬脫氧膽酸在透析液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取200 μl空白PBS各5份，加入“2.4.1”項(xiàng)下膽酸、豬脫氧膽酸系列對(duì)照品溶液各100 μl，分別配制成相當(dāng)于含0.029、0.058、0.116、0.232、0.464 mg/ml膽酸及 0.019、0.039、0.078、0.156、0.311 mg/ml豬脫氧膽酸的透析液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：膽酸y＝1.1227x+3.8697（r＝0.9997）、豬脫氧膽酸y＝1.15x+4.204（r＝0.9998）。結(jié)果二者檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為：膽酸0.029～0.464 mg/ml、豬脫氧膽酸0.019～0.311 mg/ml。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別在BSA溶液、透析液中加入質(zhì)量濃度分別為膽酸0.51、1.025、2.05 mg/ml及豬脫氧膽酸0.59、1.18、2.36 mg/ml的對(duì)照品溶液，每種質(zhì)量濃度平行6份，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果3種質(zhì)量濃度BSA溶液中膽酸的回收率分別為98.7%、97.7%、101.4%，RSD分別為2.7%、4.4%、1.6%（n＝6）；3種質(zhì)量濃度透析液中膽酸的回收率分別為104.8%、99.7%、101.6%，RSD分別為0.6%、4.6%、1.6%（n＝6）。在3種質(zhì)量濃度BSA溶液中豬脫氧膽酸的回收率分別為98.8%、103.2%、99.9%，RSD分別為3.5%、1.3%、3.5%（n＝6）；3種質(zhì)量濃度透析液中豬脫氧膽酸的回收率分別為99.5%、101.3%、99.8%，RSD分別為3.8%、4.07%、5.4%（n＝6）。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 日內(nèi)精密度：取“2.4”項(xiàng)下含0.058、0.116、0.232 mg/ml膽酸及0.039、0.078、0.156 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品和透析液樣品，每個(gè)樣品同日內(nèi)進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)精密度。結(jié)果膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.66%、0.89%、1.07%（n＝5），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.70%、1.84%、1.68%（n＝5）；豬脫氧膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為0.06%、0.5%、0.5%（n＝5），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為0.2%、0.4%、1.0%（n＝5）。

2.6.2 日間精密度：取“2.4”項(xiàng)下含0.058、0.116、0.232 mg/ml膽酸及0.039、0.078、0.156 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品和透析液樣品，每日進(jìn)樣測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。結(jié)果膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.51%、1.85%、1.92%（n＝3），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.94%、1.82%、1.80%（n＝3）；豬脫氧膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.7%、4.1%、3.9%（n＝3），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為2.2%、3.2%、4.2%（n＝3）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在BSA溶液、透析液中加入質(zhì)量濃度為0.51、1.025、2.05 mg/ml膽酸及0.59、1.18、2.36 mg/ml豬脫氧膽酸的對(duì)照品溶液，制成蛋白樣品和透析液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，室溫下保存，分別于0、2、6、10、16、30 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為0.74%、0.61%、0.78%（n＝6），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為0.64%、0.61%、0.32%（n＝6）；豬脫氧膽酸在3種質(zhì)量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.8%、1.2%、3.9%（n＝6），在3種質(zhì)量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.5%、1.1%、3.3%（n＝6）。表明樣品在室溫下放置30 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 蛋白結(jié)合率的測(cè)定[8-9]

將管狀透析袋一端用線結(jié)扎使不漏液，用移液管精密量取BSA溶液1 ml加入透析袋中，另一端折疊并用線結(jié)扎袋口，袋內(nèi)保留少量空氣，使透析袋能懸浮在透析液中。將透析袋置于盛有10 ml透析液的廣口瓶中，調(diào)節(jié)袋內(nèi)外液面高度，使保持同一水平。分別加入膽酸、豬脫氧膽酸對(duì)照品溶液適量，使透析外液的質(zhì)量濃度均分別為0.51、1.01、2.02 mg/ml，最后用封口膜封住瓶口，每種質(zhì)量濃度平行3份。于37℃恒溫震蕩30 h，到達(dá)平衡時(shí)間后，吸出袋外少量透析液，加等量10%高氯酸溶液，檢查有無(wú)蛋白漏出。若袋外透析液變渾濁，則作廢。取出透析袋，用濾紙吸干附著于袋外壁上的透析液，分別精密吸取袋內(nèi)BSA溶液100 μl、袋外透析液100 μl作為蛋白樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。按公式計(jì)算蛋白結(jié)合率，蛋白結(jié)合率＝（袋內(nèi)藥物質(zhì)量濃度－袋外藥物質(zhì)量濃度）/袋內(nèi)藥物質(zhì)量濃度×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 膽酸、豬脫氧膽酸與BSA的結(jié)合率測(cè)定結(jié)果Tab 1 Binding rate results of CA or HDCA with bovine serum albumin

2.9 平衡時(shí)間的確定

在透析袋內(nèi)以1 ml透析液代替BSA溶液，透析袋外液中膽酸、豬脫氧膽酸的質(zhì)量濃度分別為2.02、1.01、0.51 mg/ml，在9、18、30 h時(shí)測(cè)定二者在透析袋內(nèi)、外的質(zhì)量濃度，以二者質(zhì)量濃度比值確定藥物從袋內(nèi)、外自由擴(kuò)散達(dá)到平衡的時(shí)間。結(jié)果30 h時(shí)袋內(nèi)、外溶液中藥物的質(zhì)量濃度基本相等，表明擴(kuò)散30 h已達(dá)到平衡，因此設(shè)定平衡透析時(shí)間為30 h。平衡時(shí)間的考察結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 藥物在透析膜上的吸附

將透析袋內(nèi)加入1 ml空白PBS，在透析袋外加入10 ml PBS及質(zhì)量濃度為5.56、11.11、22.22 mg/ml的膽酸溶液或豬脫氧膽酸溶液各1 ml，每種質(zhì)量濃度平行3份，當(dāng)藥物達(dá)到平衡后，測(cè)定透析袋外藥物濃度。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]計(jì)算3種質(zhì)量濃度的膽酸、豬脫氧膽酸在透析膜上的吸附率分別為5.04%、3.54%、1.89%及6.53%、7.43%、5.04%，表明透析袋對(duì)膽酸及豬脫氧膽酸雖有微弱的吸附，該吸附量可忽略不計(jì)。

表2 平衡時(shí)間的考察結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of equilibrium time（n＝3）

3 討論

平衡透析法的平衡溫度一般可選在37℃或4℃恒溫條件下測(cè)定。本試驗(yàn)采用37℃為溫育溫度以模擬正常人體體溫。本試驗(yàn)中采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500的透析膜進(jìn)行試驗(yàn)，由高效液相色譜圖可知，與透析液比較，透析袋外液的樣品圖譜基線較平穩(wěn)，無(wú)明顯雜質(zhì)峰，表明蛋白中并無(wú)大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)從透析袋中滲出。此外，透析袋對(duì)藥物的吸附微量，不影響測(cè)定結(jié)果，表明采用該型號(hào)的透析袋以平衡透析法測(cè)定膽酸類(lèi)化合物的蛋白結(jié)合率是可行的。

本研究結(jié)果顯示，高效液相色譜法測(cè)定膽酸與BSA結(jié)合率試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏與選擇性高的特點(diǎn)；且膽酸、豬脫氧膽酸與BSA具有中等強(qiáng)度的蛋白結(jié)合率，即為膽酸類(lèi)小分子在體內(nèi)被蛋白儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)提供條件的同時(shí)，膽酸類(lèi)化合物在體內(nèi)不易因游離濃度過(guò)大而產(chǎn)生副作用；在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，蛋白結(jié)合率與透析液的藥物濃度無(wú)關(guān)，同時(shí)，二者與蛋白的結(jié)合率沒(méi)有明顯差異。

[1]尤承忠，湯文浩.膽汁酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)消化系統(tǒng)分冊(cè)，2004，24（1）：52.

[2]張久聰，聶青和.膽汁酸代謝及相關(guān)進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2008，17（11）：953.

[3]王志宇，茍國(guó)敬，王淑靜，等.層狀復(fù)合氫氧化物運(yùn)載氟尿嘧啶與牛血清白蛋白結(jié)合率的檢測(cè)[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（6）：503.

[4]郭賓，李川.藥物與血漿蛋白結(jié)合的藥理學(xué)基礎(chǔ)及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（3）：241.

[5]魏鋒，鐘敏，尼加提，等.HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定牛膽粉中3種膽酸類(lèi)成分的含量[J].藥物分析雜，2009，29（1）：21.

[6]江英橋.HPLC-ELSD法測(cè)定清開(kāi)靈注射液中膽酸和豬脫氧膽酸的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（4）：31.

[7]Qiao X，Ye M，Pan DL，et al.Differentiation of various traditional chinese medicines derived from animal bile and gallstone：simultaneous determination of bile acids by liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2011，1218（1）：107.

[8]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1454-1456.

[9]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：708-709.

[10]盧來(lái)春，蔣學(xué)華，楊俊毅，等.阿莫西林對(duì)格列美脲血漿蛋白結(jié)合率的影響[J].華西藥學(xué)雜志，2003，18（4）：246.