HPLC法測定三種制劑中水楊酸的含量

白 林，蔡 樂，徐風(fēng)華，王歡歡（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853）

水楊酸軟膏、水楊酸硫軟膏、復(fù)方硫軟膏收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》[1]，三種制劑處方中均含有水楊酸，其共同的特點是抗真菌、止癢，常用于皮膚癬癥、真菌感染及皮炎濕疹等。以上制劑應(yīng)用多年，是臨床療效顯著的醫(yī)院制劑，在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，復(fù)方硫軟膏中的水楊酸無含量測定項；水楊酸軟膏、水楊酸硫軟膏中水楊酸的含量測定方法為酸堿滴定法，由于軟膏基質(zhì)為酸性，對水楊酸含量測定的結(jié)果有影響，導(dǎo)致結(jié)果易偏高。本實驗建立一種HPLC法，用于三種制劑中水楊酸的含量測定，以期為有效控制制劑質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列四元泵、在線脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器和化學(xué)工作站，美國Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）。

水楊酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100106-201104）；甲醇為色譜純、磷酸二氫鈉為分析純。水楊酸軟膏（本院自制，規(guī)格：20 g，批號20130415、20130416、20130417）；水楊酸硫軟膏（本院自制，規(guī)格：20 g，批號20130415、20130416、20130417）；復(fù)方硫軟膏（本院自制，規(guī)格：20 g，批號20130420、20130421、20130422）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇- 0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉（30∶70）；檢測波長：231 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液：取水楊酸對照品約0.030 8 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液（含水楊酸308 μg·mL-1）；精密量取上述儲備液5 mL，置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（水楊酸61.6 μg·mL-1）。

（2）供試品溶液：分別取水楊酸軟膏、水楊酸硫軟膏、復(fù)方硫軟膏（含水楊酸均為3%）約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加無水乙醇約30 mL，置于水浴加熱振搖使溶化，放冷至室溫，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，冰浴1 h后，精密量取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）陰性對照溶液：按處方比例取除水楊酸以外的其余成分，按三種制劑的制備工藝制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，水楊酸的保留時間約為8 min，分離度大于2.0，理論塔板數(shù)以水楊酸峰計算大于5000。詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品儲備液并以流動相為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含水楊酸分別為12.32、30.80、61.60、92.40、123.20 μg·mL-1，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y = 27.073 8 X – 3.250 6，r = 1.000 0。實驗表明水楊酸在12.32 ~ 123.20 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，水楊酸RSD為0.48%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

分別取水楊酸軟膏（批號20130415）、水楊酸硫軟膏（批號20130415）、復(fù)方硫軟膏（批號20130420）適量，按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，水楊酸在水楊酸軟膏、水楊酸硫軟膏、復(fù)方硫軟膏的含量及RSD（n = 6）分別為99.82%、0.34%；101.64%、0.87%；98.74%、0.41%。表明本方法重復(fù)性良好。

圖1 水楊酸HPLC色譜圖A – 對照品，B – 水楊酸軟膏供試品，C – 水楊酸硫軟膏供試品，D –復(fù)方硫軟膏供試品，E – 水楊酸軟膏陰性對照，F(xiàn) – 水楊酸硫軟膏陰性對照，G – 復(fù)方硫軟膏陰性對照；1 – 水楊酸Fig 1 HPLC chromatograms of the salicylic acidA – reference substance, B – salicylic acid ointment sample, C –salicylic acid and sulfur ointment sample, D – compound sulfur sublimate ointment sample, E – negative reference for salicylic acid ointment, F – negative reference for salicylic acid and sulfur ointment,G – negative reference for compound sulfur sublimate ointment; 1 –salicylic acid

2.7 穩(wěn)定性實驗

取上述三種制劑，按供試品溶液制備方法配制供試液，分別在0、1、3、6、9 h進(jìn)樣10 μL，水楊酸軟膏（批號20130415）、水楊酸硫軟膏（批號20130415）、復(fù)方硫軟膏（批號20130420）中水楊酸的峰面積平均值、RSD分別為1 624.6、0.62%；1 633.8、0.56%；1 651.6、0.39%。

2.8 回收率實驗

取水楊酸分別精密稱定，按處方比例分別加入其余成分，按三種制劑的制備工藝制成樣品，按供試品溶液制備方法制成樣品溶液。依照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1 ~ 3。

2.9 樣品含量測定

三批水楊酸軟膏（批號20130415、20130416、20130417）水楊酸的標(biāo)示量分別為99.82%、101.38%、100.67%。三批水楊酸硫軟膏（批號20130415、20130416、20130417）水楊酸的標(biāo)示量分別為101.64%、102.67%、98.45%。三批復(fù)方硫軟膏（批號20130420、20130421、20130422）水楊酸的標(biāo)示量分別為98.74%、97.58%、101.09%。

表1 水楊酸軟膏回收率實驗測定結(jié)果Tab 1 Recovery test of salicylic acid ointment

表2 水楊酸硫軟膏回收率實驗測定結(jié)果Tab 2 Recovery test of salicylic acid and sulfur ointment

表3 復(fù)方硫軟膏回收率實驗測定結(jié)果Tab 3 Recovery test of compound sulfur sublimate ointment

3 討論

3.1 水楊酸含量測定方法的選擇

水楊酸的含量測定方法主要有中和法[2-3]、紫外分光光度法[4-5]等。由于軟膏基質(zhì)為酸性，因此中和法測定軟膏中水楊酸對于結(jié)果的影響為含量偏高。由于軟膏基質(zhì)中羊毛脂有紫外吸收，用紫外分光光度法直接測定水楊酸的含量，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。參考文獻(xiàn)[6-8]以高效液相色譜法測定復(fù)方制劑中的水楊酸，以甲醇-水（40∶60）、甲醇-冰醋酸（45∶55）、甲醇-0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉（52∶48）、（30∶70）分別作為流動相進(jìn)行比較，甲醇- 0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉（30∶70）為流動相，柱溫35 ℃[9]，檢測波長為231 nm，峰形較好，雜質(zhì)峰無干擾，靈敏度高。

3.2 樣品中水楊酸提取方法的選擇

提取軟膏中的水楊酸，以甲醇、乙醇分別作為溶劑，水楊酸在乙醇中溶解性好，提取完全，溶劑對人體和環(huán)境的污染少。常溫時軟膏黏度較大，取樣后轉(zhuǎn)移至容量瓶中難度較大。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)80 ℃的乙醇可將基質(zhì)軟化，提高基質(zhì)流動性，樣品轉(zhuǎn)移完全。使用乙醇提取后，冰浴1 h使輔料沉淀，濾過后加入流動相稀釋，混勻后再用0.22 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣，以減小供試品對色譜柱的損害。

3.3 取樣量的計算

以上三種制劑中水楊酸的含量按3%計算，取樣量均為0.5 g。在《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》[1]中三種制劑有不同的規(guī)格，如水楊酸軟膏尚有高于和低于此規(guī)格的情況，可根據(jù)不同的規(guī)格進(jìn)行折算取樣量。

結(jié)果表明，本方法操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，用同一種方法可解決上述三種制劑中水楊酸的含量測定問題。