HPLC-MS/MS法測(cè)定全血中他克莫司的濃度

趙冠人，申 健，彭明麗，蔣 南（.解放軍309醫(yī)院藥劑科，北京 0009；.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）是從鏈霉菌的代謝物中分離得到的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑，臨床上廣泛用于預(yù)防和治療器官移植后的排異反應(yīng)，其藥效強(qiáng)度是環(huán)孢素的50 ~ 100倍[1]。但他克莫司不良反應(yīng)明顯、治療窗窄、生物利用度低，在藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)上存在明顯的個(gè)體差異[2]，給臨床治療增加了難度，因此在實(shí)際應(yīng)用中需進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)。

目前常用的他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[3]、微粒子酶免疫分析法（MEIA）[4]、高效液相色譜法（HPLC）[5]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）法[6]等。其中，ELISA法和MEIA法對(duì)他克莫司的體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值高；HPLC法的靈敏度無(wú)法完全滿足體內(nèi)他克莫司的測(cè)定范圍；HPLCMS/MS法靈敏度高，且只測(cè)定原型藥物，能更準(zhǔn)確地表達(dá)體內(nèi)他克莫司的含量，可廣泛用于治療藥物監(jiān)測(cè)。本研究以地西泮為內(nèi)標(biāo)，旨在建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏的HPLC-MS/MS法測(cè)定人全血中他克莫司的濃度。

1 儀器與試藥

API3200型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有離子噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Applied Biosystem公司）；Prominence LC-20A超快速高效液相色譜系統(tǒng)，包括CBM-20A系統(tǒng)控制器，LC-20AD二元輸液泵，DGU-20A3脫氣裝置，SIL-20AHT自動(dòng)進(jìn)樣器（日本Shimadzu公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；5420型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；MG-2200型氮?dú)獯蹈蓛x（東京理化器械株式會(huì)社）。

他克莫司（杭州中美華東制藥有限公司，純度：99%，批號(hào)20120604）；地西泮（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)171225）；甲醇、乙腈和醋酸銨均為色譜純，硫酸鋅為分析純，水為Milli-Q制備超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm（25 ℃）；空白全血樣品由解放軍第309醫(yī)院輸血科提供，患者血液樣品由解放軍第309醫(yī)院器官移植中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 質(zhì)譜條件 離子源：離子噴霧離子化源（ion spray）；離子噴射電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：450 ℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）：20 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，N2）：60 psi；氣簾氣體壓力（Cur Gas）：30 psi。正離子方式檢測(cè)；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；DP：67；EP：67；CE：36；CXP：7；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 821.6→768.5（他克莫司）和m/z 285.1→193.1（地西泮）。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SBC18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為乙腈溶液，B為含有0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%甲酸的水溶液，采用梯度洗脫，0.01 ~ 0.50 min，A-B（65∶35）→（95∶5），0.51 ~ 2.40 min，A-B（95∶5）；2.41 ~ 5.00 min，A-B（65∶35）；流速0.7 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取他克莫司對(duì)照品適量，加乙腈溶解，定量配制成14.89、29.78、59.56、119.12、238.24、297.79 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取地西泮適量，加乙腈溶解，定量配制成32.37 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，上述溶液置于6 ℃冰箱儲(chǔ)存。

2.2.2 硫酸鋅溶液的制備 精密稱取硫酸鋅七水合物適量，加純化水溶解，配制成0.02 mol·L-1硫酸鋅溶液。

2.3 全血樣品的處理

取全血樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻，加入硫酸鋅溶液100 μL，渦旋混合0.5 min，加入甲醇800 μL，渦旋混合1 min，14 000 r·min-1離心12 min，取上清液于50 ℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)眉状?00 μL溶解，渦旋混合1 min，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2.4 質(zhì)譜分析

采取正離子方式檢測(cè)，將他克莫司溶于流動(dòng)相中，按“2.1.1”項(xiàng)下操作，于二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中獲得他克莫司準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 821.6，選擇該準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)電離，生成主要的碎片離子峰m/z 768.5用于定量。

2.5 方法專(zhuān)屬性考察

分別取空白全血、加入適量他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的全血樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，另取他克莫司和內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品溶液，依“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，他克莫司的保留時(shí)間約為2.4 min，內(nèi)標(biāo)地西泮的保留時(shí)間約為1.8 min，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明本方法具有較高的特異性。

圖1 他克莫司和內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖A – 空白全血樣品，B – 他克莫司和內(nèi)標(biāo)，C – 他克莫司和內(nèi)標(biāo)的全血樣品；1 – 內(nèi)標(biāo)（地西泮），2 – 他克莫司Fig 1 Chromatograms of tacrolimus and diazepamA – blank whole blood, B – tacrolimus and internal standard, C – blank whole blood with tacrolimus and internal standard; 1 – internal standard(diazepam), 2 – tacrolimus

2.6 線性關(guān)系考察

平行吸取6份空白全血90 μL，分別加入10 μL他克莫司標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，配制成相當(dāng)于全血濃度為1.49、2.98、5.96、11.91、23.82、29.78 ng·mL-1的全血樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，依照“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對(duì)濃度（C）進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程：Y = 4.80 C +2.62×10-3（r = 0.999 2），他克莫司在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限為0.50 ng·mL-1。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

精密吸取空白全血100 μL于1.5 mL離心管中，不加內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項(xiàng)下操作，向獲得的上清液中分別精密加入他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配制低、中、高三個(gè)濃度（分別為2.98、11.91、29.78 ng·mL-1），取5 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定他克莫司色譜峰面積，求出與對(duì)照品溶液測(cè)得峰面積的比值為基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)均在85% ~ 115%范圍內(nèi)。

2.8 準(zhǔn)確度與精密度

分別于90 μL的空白全血中加入低、中、高3種濃度的他克莫司對(duì)照品溶液10 μL，混勻，得低、中、高3種不同濃度他克莫司的全血樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，依法測(cè)定批內(nèi)與批間的準(zhǔn)確度與精密度（3 d），詳見(jiàn)表1。

表1 他克莫司的準(zhǔn)確度與精密度. n = 6Tab 1 Precision and accuracy of tacrolimus. n = 6

2.9 提取回收率

配制他克莫司低、中、高濃度（2.98、11.91、29.78 ng·mL-1）全血樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下操作后依法進(jìn)樣，記錄峰面積。另取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的全血空白基質(zhì)，分別加入3個(gè)相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。以每一濃度兩種處理方法得到的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，他克莫司各濃度提取回收率均在85% ~ 115%范圍內(nèi)。

2.1 0 穩(wěn)定性考察

分別取他克莫司低、中、高濃度（2.98、11.91、29.78 ng·mL-1）質(zhì)控樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，每一濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，考察全血樣本室溫放置24 h、經(jīng)過(guò)3次凍融后他克莫司的穩(wěn)定性，測(cè)得濃度與0時(shí)刻比較，變化率均小于15%，表明在上述儲(chǔ)存條件下樣品較穩(wěn)定。

2.1 1 臨床應(yīng)用

測(cè)定我院24例腎移植患者谷濃度血樣（晨起給藥前靜脈血），按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，取上清液5 μL依法進(jìn)樣，記錄FK506峰面積，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算FK506濃度，濃度范圍為4.21 ~ 12.86 ng·mL-1，濃度均值為（8.14 ± 2.62） ng·mL-1。

3 討論

本研究建立HPLC-MS/MS法測(cè)定全血中他克莫司濃度的方法，較以往檢測(cè)方法有如下改進(jìn)：1）線性范圍方面，王立明等[7]研究發(fā)現(xiàn)全血FK506的理想治療窗濃度范圍應(yīng)為：術(shù)后第1個(gè)月內(nèi)為11 ~ 15 ng·mL-1，第2 ~ 3個(gè)月為8 ~ 11 ng·mL-1，第3個(gè)月以后為5 ~ 8 ng·mL-1，本實(shí)驗(yàn)建立測(cè)定方法在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可完全滿足他克莫司日常治療藥物監(jiān)測(cè)需求。2）全血樣本前處理方面，他克莫司在全血中大部分與紅細(xì)胞結(jié)合，少量與脂蛋白結(jié)合，故測(cè)定他克莫司血藥濃度需使用全血，且須充分沉淀蛋白以使其轉(zhuǎn)化成游離狀態(tài)，再加入破紅細(xì)胞劑硫酸鋅，便于提取完全。文獻(xiàn)[8]報(bào)道有乙醚萃取法，操作較為復(fù)雜，也有用3倍量乙腈沉淀蛋白[9-10]的報(bào)道，但沉淀比例不夠充分，本實(shí)驗(yàn)采用8倍量甲醇沉淀蛋白，氮?dú)獯抵翚堅(jiān)笥眉状既芙怆x心，可起到二次沉淀的作用，此方法在保證蛋白沉淀完全的同時(shí)起到增加方法靈敏度的效果。3）流動(dòng)相優(yōu)化方面，文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道水相一般為不同比例的醋酸銨溶液，本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，水相中添加醋酸銨可有效改善他克莫司的峰形，但與其濃度高低的相關(guān)性不大；然而，流動(dòng)相的酸度高低可對(duì)其峰形產(chǎn)生顯著影響。通過(guò)在水相中添加0.1%、0.2%、0.5%甲酸用以優(yōu)化他克莫司峰形，結(jié)果表明0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%的甲酸溶液作為水相的條件下分離效果較好，故采用之。4）內(nèi)標(biāo)選擇方面，文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道多用子囊霉素、環(huán)孢素D為內(nèi)標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用地西泮作為內(nèi)標(biāo)，地西泮的質(zhì)譜檢測(cè)條件和極性與他克莫司相似，且價(jià)格較為低廉，可使他克莫司血藥濃度的日常測(cè)定更加經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。