四君子湯對脾虛證大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡及C aspase?3表達(dá)的影響

趙盛云 ，王垂杰

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，沈陽 110847；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110001；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，沈陽 110032）

在中醫(yī)消化領(lǐng)域，脾虛證主要是指因脾胃氣虛，受納、腐熟、運(yùn)化功能失常所致的胃脘疼痛、腹脹、納呆、惡嘔、噯氣、便溏等一組中醫(yī)證候。脾虛證是慢性胃炎和胃潰瘍等慢性胃病最常見的中醫(yī)證型［1～3］。慢性胃病的發(fā)生是由于胃黏膜損傷因素和胃黏膜防御機(jī)制之間平衡的破壞，特別是胃黏膜屏障防御功能的破壞所致。慢性胃病發(fā)病過程中，黏膜損傷的慢性過程也很符合脾虛證具有的慢性的、虛性的與正常體質(zhì)呈漸變關(guān)系的病理特點(diǎn)。目前，對胃黏膜和黏液屏障與脾虛證相關(guān)性的系統(tǒng)性研究較少見［4］。本研究通過比較脾虛證大鼠藥物干預(yù)前后胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡變化情況和Caspase?3的變化情況，揭示了脾虛證與胃黏膜屏障的關(guān)系及其在慢性胃病發(fā)病過程中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級SD大鼠102只，體質(zhì)量180～210 g，雌雄各半，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2009?0004］。飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：室溫20～24℃，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.1.2 藥物：小承氣湯由厚樸、枳實(shí)、大黃（比例3∶3∶2）［5］組成；四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草（比例2∶2∶2∶1）組成。中藥材均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，并由該院制劑室制成100%煎劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Caspase?3 Antibody、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.1.3 儀器與軟件：Leica Q550CW圖象采集和分析系統(tǒng)（德國徠卡公司）。數(shù)碼顯微鏡（OBX41）和生物顯微鏡（CHA）（日本OLYMPUS公司）。應(yīng)用SPSS11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后，隨機(jī)分成4組，正常對照組24只，長期造模組、自然恢復(fù)組和四君子湯組各26只。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備：脾虛證模型建立采用耗氣破氣藥物、饑飽失常和勞累三因素復(fù)合造模法，即小承氣湯（1.5 mL/100 g）隔日1次灌胃，灌胃當(dāng)日禁食，次日足量喂食且游泳至耐力極限。

1.2.3 給藥方法：正常對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，前4周生理鹽水1.5 mL/100 g隔日1次灌胃，后3周生理鹽水1.5 mL/100 g每日1次灌胃共7周。長期造模組大鼠以上述造模方法喂養(yǎng)7周。自然恢復(fù)組前4周喂養(yǎng)方法同長期造模組，后3周改為常規(guī)喂養(yǎng)。四君子湯組喂養(yǎng)方法前4周同長期造模組，后3周改為常規(guī)飼養(yǎng)的同時(shí)用四君子湯1.5 mL/100 g每日1次灌胃。于第7周末處死大鼠后取材處理。

1.2.4 指標(biāo)檢測：采用TUNEL法檢測胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性。于凋亡陽性細(xì)胞分布區(qū)域，光鏡（×400）下隨機(jī)選擇5個(gè)互不重疊的視野，測定單位面積陽性細(xì)胞表達(dá)的光密度（OD）值作為其表達(dá)情況的指標(biāo)。采用ABC免疫組化法檢測Caspase?3表達(dá)情況，細(xì)胞核染為棕黃色者為陽性染色，光鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況

與正常對照組比較，各組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡均增加，尤以長期造模組增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。經(jīng)四君子湯治療后，大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡明顯減少，與長期造模組及自然恢復(fù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.05）。

表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況的比較（±s）Tab.1 Comparison of programmed cell death level in rat gastric mucosa（±s）

表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況的比較（±s）Tab.1 Comparison of programmed cell death level in rat gastric mucosa（±s）

1）compared with the normal control group，P＆lt;0.05；2）com?pared with the Sijunzi decoction group，P＆lt;0.05.

Group n OD Normal control group 8 2.13±0.183 Long?term model group 8 29.95±0.6481），2）Natural recovery group 8 25.13±0.4131），2）Sijunzi decoction group 8 18.45±0.5731）

2.2 各組大鼠胃黏膜組織Caspase?3含量的變化

與正常對照組比較，各組大鼠胃黏膜組織Cas?pase?3含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。經(jīng)四君子湯治療后，大鼠胃黏膜組織Caspase?3含量明顯降低，與長期造模組及自然恢復(fù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.05）。

表2 各組大鼠胃黏膜組織Caspase?3含量的比較（±s）Tab.2 Comparison of Caspase?3 level in the rat gastric mucosa（±s）

表2 各組大鼠胃黏膜組織Caspase?3含量的比較（±s）Tab.2 Comparison of Caspase?3 level in the rat gastric mucosa（±s）

1）compared with the normal control group，P＆lt;0.05；2）compared with the Sijunzi decoction group，P＆lt;0.05.

Group n Caspase?3 Normal control group 8 0.176 0±0.004 6 Long?term model group 8 0.235 6±0.005 01），2）Natural recovery group 8 0.214 0±0.007 61），2）Sijunzi decoction group 8 0.207 0±0.003 81）

3 討論

作為營養(yǎng)通道，胃之所以能夠在生理范圍內(nèi)經(jīng)受高溫食物、高滲與低滲液體、高濃度酒精、吸煙、非甾體類抗炎藥、胃酸及消化蛋白酶等各種內(nèi)源性、外源性物質(zhì)的刺激與挑戰(zhàn)，得益于胃具有與其功能相適應(yīng)的胃黏膜屏障防御體系［6］。Wallance等［7］將參與胃黏膜防御的各種因素分為5級，其中細(xì)胞凋亡對黏膜上皮、腺體的損傷、再生、修復(fù)有很大的影響，在胃黏膜屏障的第5道防線中起重要作用。本研究選取的觀測指標(biāo)Caspase?3作為最重要的效應(yīng)Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是多種凋亡刺激信號傳遞的終結(jié)點(diǎn)，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必由之路，因此是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵酶。

本研究中大鼠胃黏膜在遭受致病因子的侵襲后，黏膜Caspase?3含量明顯增加，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖間的平衡受到破壞，局部黏膜細(xì)胞數(shù)量減少，黏膜屏障保護(hù)功能下降，造成胃黏膜疾病的發(fā)生。這說明通過施加耗氣破氣藥物灌胃、饑飽失常和勞累過度這些傷脾害胃的造模因素，使得大鼠具備了扎堆、瞇眼、食少、便溏等脾虛癥狀后，其胃黏膜的防御機(jī)制的微觀指標(biāo)隨之發(fā)生變化，從而導(dǎo)致胃黏膜屏障功能的下降，進(jìn)一步導(dǎo)致慢性胃病的發(fā)生。自然恢復(fù)組大鼠造模后胃黏膜Caspase?3含量下降，后期通過自我修復(fù)機(jī)制，在一定程度上減少了胃黏膜細(xì)胞凋亡，修復(fù)了黏膜屏障，但仍未恢復(fù)到正常水平。四君子湯組經(jīng)過治療后，大鼠一系列脾虛癥狀明顯好轉(zhuǎn)，胃黏膜局部Caspase?3含量下降，凋亡情況好于自然恢復(fù)組。說明四君子湯通過益氣健脾改善了大鼠脾虛證，同時(shí)增強(qiáng)了其胃黏膜屏障功能，減少了損傷的胃黏膜的細(xì)胞凋亡，從而對慢性胃病起到治療作用。這就為探索中藥胃黏膜保護(hù)劑和健脾益氣中藥的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對提高慢性胃病臨床療效及減少慢性胃病的發(fā)病具有一定指導(dǎo)意義。

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