18F?FLT 和18F?FD G PET?CT 顯像評(píng)價(jià)Wistar大鼠Walker256腫瘤化療后的早期療效

徐微娜，于樹鵬，辛軍，郭啟勇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004）

判斷抗腫瘤治療效果的傳統(tǒng)方法是檢測(cè)治療引起的腫瘤大小的變化，一般需要較長(zhǎng)時(shí)間（平均為幾個(gè)月）。對(duì)于一些難治性腫瘤，早期評(píng)價(jià)治療反應(yīng)可以在腫瘤大小改變之前調(diào)整治療方案，避免不必要的毒性及經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)。惡性腫瘤一個(gè)重要的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞的增殖活性，因此腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測(cè)對(duì)于評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)具有重要的意義［1］。隨著PET?CT在臨床應(yīng)用的開展，應(yīng)用正電子藥物評(píng)價(jià)腫瘤治療效果（尤其是治療后早期療效）成為可能。目前臨床應(yīng)用最為廣泛的正電子顯像劑是18F?FDG，但由于其反映的僅是葡萄糖代謝水平，特異性較差。18F?FLT作為嘧啶類似物在臨床前及臨床的研究中初步得出了一些結(jié)果［2～7］，但是其作用機(jī)制及對(duì)腫瘤診斷的意義我們還不完全清楚，對(duì)于不同的腫瘤及不同的治療方式所得結(jié)果也不盡相同［8］，還需要更多的研究來探索18F?FLT在腫瘤診斷及療效評(píng)價(jià)中的價(jià)值。本研究對(duì)比化療后早期腫瘤18F?FLT及18F?FDG攝取的變化及其與腫瘤細(xì)胞增殖活性之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量（120±20）g，清潔級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。荷Walker256腹水瘤Wistar大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，清潔級(jí)。示蹤劑18F?FLT和18F?FDG由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院PET?CT中心合成，F(xiàn)LT和FDG前體由常熟華益化工有限公司生產(chǎn)。正電子藥物合成系統(tǒng)為GE公司生產(chǎn)的Minitrace藥物合成系統(tǒng)。PET?CT為GE公司生產(chǎn)的Discovery ST16 PET?CT?；熕幬锉砣岜刃怯烧憬Ｕ帢I(yè)股份有限公司生產(chǎn)。增殖細(xì)胞核抗原（Ki?67）免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 荷Walker 256腫瘤大鼠模型的制備：將荷Walker 256瘤大鼠飼養(yǎng)至腹部彭隆，從腹水型Walk?er256瘤株大鼠腹腔中抽取淡黃色腹水5～6 mL，用生理鹽水稀釋成4×107/mL細(xì)胞懸液備用。用注射器于大鼠右前腋部皮下接種Walker256細(xì)胞，0.2 mL/只，7～10 d成瘤。當(dāng)接種部位腫瘤最大徑長(zhǎng)至1.5～2.0 cm左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理：30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、化療后24 h組和化療后48 h組，每組10只?；熀?4 h組和化療后48 h組大鼠尾靜脈注射表柔比星，表柔比星稀釋成1 mg/mL，按5 mg/kg給藥，體積約0.5～0.7 mL，2組分別于化療后24 h及48 h行18F?FLT及18F?FDG PET?CT顯像（各5只）。對(duì)照組大鼠尾靜脈注射同等體積的生理鹽水，分別行18F?FLT及18F?FDG PET?CT顯像（各5只）。

1.2.318F?FLT及18F?FDG PET?CT顯像及圖像處理：各組Wistar大鼠尾靜脈分別注射18F?FLT及18F?FDG 0.5 mCi，0.2 mL（18.5 MBq/0.2mL），注射前后分別測(cè)定注射器放射性活度。注射顯像劑后40 min腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，注射顯像劑后1 h行PET?CT顯像。大鼠麻醉后俯臥于泡沫固定板，置于PET?CT成像系統(tǒng)內(nèi)（GE公司Discovery ST16 PET?CT），CT 采集條件：120 kV，60 mA，層厚5 mm；PET采用3D采集模式，3 min/床位，掃描范圍從頭頂?shù)轿膊俊D像后處理系統(tǒng)為GE公司Xeleris工作站。數(shù)據(jù)處理：將采集數(shù)據(jù)在Xeleris工作站進(jìn)行圖像斷層、融合，定量測(cè)定腫瘤部位感興趣區(qū)內(nèi)放射性計(jì)數(shù)與對(duì)側(cè)相同部位軟組織相同面感興趣區(qū)內(nèi)放射性計(jì)數(shù)比值（T/NT）。

1.2.4 腫瘤組織處理：顯像后即刻脫臼處死大鼠，稱重后剝離腫瘤組織，生理鹽水沖洗擦干后測(cè)定腫瘤放射性活度及重量，計(jì)算每克腫瘤組織攝取放射性百分比（%ID/g）。然后放入10%的中性甲醛緩沖液固定后24 h內(nèi)石蠟包埋，制成切片及HE染色。免疫組化測(cè)定：將制成的石蠟切片經(jīng)過脫蠟和水化、抗原修復(fù)、滴加Ⅰ抗和滴加Ⅱ抗后，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片后進(jìn)行光鏡下觀察Ki?67的表達(dá)情況。涂片及切片觀察方法：Ki?67蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色或細(xì)胞質(zhì)同時(shí)呈棕黃色為陽性，單純細(xì)胞質(zhì)著色而細(xì)胞核無著色或二者均無著色為陰性。采用OLYMPUS顯微鏡在高倍鏡（×400）下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比，表示為標(biāo)記指數(shù)（labelling index，LI）。所有計(jì)數(shù)由同一人操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用±s表示，化療前后各組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，相關(guān)性比較采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PET?CT顯像結(jié)果

化療后24和48 h時(shí)PET?CT結(jié)果顯示大鼠腫瘤部位18F?FLT和18F?FDG放射性分布較對(duì)照組均降低（圖1、2）。對(duì)照組腫瘤18F?FLT放射性分布高于周圍本底，化療后24 h腫瘤18F?FLT放射性分布較對(duì)照組降低，化療后48 h腫瘤18F?FLT放射性分布較對(duì)照組進(jìn)一步降低（圖1）。對(duì)照組腫瘤18F?FDG放射性分布明顯高于周圍本底，化療后24 h腫瘤18F?FDG放射性分布較對(duì)照組降低，化療后48 h腫瘤18F?FDG放射性分布較對(duì)照組進(jìn)一步降低（圖2）。18F?FLT及18F?FDG組T/NT比值也較對(duì)照組降低（P<0.01和P<0.05），見表1。

2.2 腫瘤組織Ki?67檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞核染成褐色為增殖腫瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，化療后24和48 h Ki?67陽性細(xì)胞比例均明顯降低（P<0.001），見表1、圖3。

2.3 腫瘤18F?FLT、18F?FDG攝取與LI?Ki?67的相關(guān)性

化療后18F?FLT和18F?FDG攝?。═/NT）與LI?Ki?67均呈正相關(guān)（r=0.899，P<0.05；r=0.813，P<0.05）。18F?FLT及18F?FDG的T/NT與%ID/g之間有良好的相關(guān)性（r=0.898，P<0.05；r=0.843，P<0.05）。

圖1 化療前后腫瘤部位18F?FLT放射性分布Fig.1 18F?FLT distribution in tumor before and after chemotherapy

圖2 化療前后腫瘤部位18F?FDG放射性分布Fig.2 18F?FDG distribution in tumor before and after chemotherapy

圖3 化療前后腫瘤組織Ki?67分布 ×400Fig.3 Ki?67 distribution in tumor before and after chemotherapy ×400

表1 化療后24和48 h腫瘤組織18F?FLT和18F?FDG攝取及Ki?67的變化Tab.1 Change of Ki?67 and18F?FLT，18F?FDG uptake in tumor 24 and 48 hours after chemotherapy

3 討論

本研究結(jié)果表明，Walker256腫瘤在表柔比星化療后早期（24 h）18F?FLT攝取降低，48 h降低更加明顯，同時(shí)免疫組化檢測(cè)腫瘤組織Ki?67也出現(xiàn)了下降，表柔比星抑制了腫瘤的增殖活性，而18F?FLT PET?CT顯像可以檢測(cè)到此種變化。

表柔比星4′位置上的羥基由順位變?yōu)榉次?，為?xì)胞周期非特異性藥物，其主要作用機(jī)制與其能與DNA結(jié)合有關(guān)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞加入本品可迅速透入胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，從而抑制核酸的合成和有絲分裂。從表柔比星的作用機(jī)制可以得出，由于抑制了細(xì)胞的DNA合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞利用胸腺嘧啶脫氧核苷的量減少，因而其攝取胸腺嘧啶脫氧核苷類似物18F?FLT的量降低。18F?FLT作為嘧啶類似物在細(xì)胞增殖過程中能夠摻入DNA，但不摻入RNA。18F?FLT通過被動(dòng)擴(kuò)散和Na+依賴載體的易化轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，隨后在胸腺嘧啶核苷激酶1（TK1）的作用下發(fā)生磷酸化生成18F?FLT一磷酸鹽而滯留在細(xì)胞內(nèi)。TK1是DNA補(bǔ)救合成途徑中的一種重要的酶，在靜止細(xì)胞中無活性，但在增殖細(xì)胞的G1期后期和S期該酶活性達(dá)到最大［9］。因此，18F?FLT通過TK1催化發(fā)生磷酸化形成了其作為增殖示蹤劑的基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道TK1在惡性腫瘤細(xì)胞中的活性比在良性細(xì)胞中高3～4倍［10］，而且腫瘤細(xì)胞TK1羧基末端發(fā)生突變，使其在M期不能正常降解失活，最終導(dǎo)致TK1在腫瘤細(xì)胞中的活性異常增高［11］。因此增殖活躍的腫瘤可以攝取18F?FLT而在PET?CT上表現(xiàn)為局部放射性濃聚。由此可見Walker256腫瘤在表柔比星化療后攝取18F?FLT降低很大可能與細(xì)胞增殖活性受抑有關(guān)，18F?FLT攝取的量的多少可以反映化療后早期腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

雖然本研究表明18F?FLT攝取與細(xì)胞增殖相關(guān)，但是需要注意的是腫瘤的DNA合成有從頭合成和補(bǔ)救合成兩種途徑，不同的腫瘤其DNA合成途徑也不盡相同，或者以補(bǔ)救合成途徑為主，或者以從頭合成途徑為主［12］，而TK1僅是DNA補(bǔ)救合成途徑的酶，因此僅反映補(bǔ)救合成途徑的DNA合成?；熕幬锟梢鸩煌铣赏緩降霓D(zhuǎn)換，有些化療藥物通過抑制DNA從頭合成途徑而激活了補(bǔ)救途徑，使TK1活性增強(qiáng)，導(dǎo)致18F?FLT攝取增加。如腫瘤經(jīng)過化療藥物5?氟尿嘧啶治療后，5?氟尿嘧啶在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成5?氟尿嘧啶衍生物一磷酸脫氧核糖氟尿嘧啶核苷及三磷酸氟尿嘧啶核苷后，阻斷dTMP的合成，從而影響DNA的生物合成，使其停滯在S期從而激活DNA補(bǔ)救合成途徑，TK1活性增高。TK1活性增高會(huì)使18F?FLT攝取增加，但此時(shí)DNA合成（即細(xì)胞增殖速度）卻減慢［13］，此種情況18F?FLT的攝取就不能反映細(xì)胞的增殖。盡管不同的研究結(jié)果不盡相同，但不能因此就完全否認(rèn)18F?FLT的作用，18F?FLT攝取與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)性還需要更深入細(xì)致的研究。

不同藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制不同，作用于細(xì)胞周期的環(huán)節(jié)不同，而18F?FLT也僅是與DNA的補(bǔ)救合成途徑相關(guān)，因此對(duì)于一些以從頭合成途徑為主的腫瘤則不能反映其增殖變化。所以我們?cè)谂袛?8F?FLT攝取對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響時(shí)，一定要了解使用的抑制腫瘤藥物及其作用機(jī)制，從而通過18F?FLT攝取變化來判斷腫瘤細(xì)胞增殖狀況。臨床治療中對(duì)腫瘤患者多采用聯(lián)合化療方法，使得腫瘤DNA合成變化更加復(fù)雜，引起攝取18F?FLT的變化也不盡相同，因此對(duì)不同的腫瘤以及不同的治療方式還需要更多的臨床前及臨床研究加以了解及認(rèn)證［14］。

18F?FDG攝取在腫瘤化療后早期也出現(xiàn)了降低的改變，分析原因可能與18F?FDG的攝取機(jī)制有關(guān)。細(xì)胞18F?FDG攝取主要依賴于細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體及己糖（磷酸）激酶的活性。表柔比星治療后腫瘤組織18F?FDG攝取降低，可能是由于表柔比星降低了己糖（磷酸）激酶的活性，從而使腫瘤細(xì)胞攝取18F?FDG降低；或者由于表柔比星抑制腫瘤細(xì)胞的分裂從而使腫瘤細(xì)胞利用能量減少，而腫瘤能量的主要來源為葡萄糖，因此葡萄糖利用降低，導(dǎo)致18F?FDG攝取減少。因此腫瘤細(xì)胞攝取18F?FLT降低是由于腫瘤細(xì)胞增殖降低，而18F?FDG攝取減少是細(xì)胞增殖降低的間接結(jié)果，因此18F?FDG代謝在一定程度上也可以間接反映細(xì)胞增殖，但其影響因素相對(duì)較多，如血糖水平、腦組織的功能狀態(tài)等都會(huì)引起腫瘤組織18F?FDG攝取的變化。18F?FDG攝取可以部分反映細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖活性是影響18F?FDG攝取的一個(gè)因素。

與18F?FDG相比，18F?FLT在大鼠腫瘤組織攝取較低，心臟及腦組織分布較少，而且在大鼠體內(nèi)分布比較穩(wěn)定，所受影響因素較少。而18F?FDG受血糖及腦功能狀態(tài)的影響，心臟及腦組織攝取18F?FDG變化較大，影響腫瘤定量測(cè)定的結(jié)果。因此18F?FLT顯像重復(fù)性好，更適合于腫瘤治療療效的評(píng)價(jià)。

本研究結(jié)果表明，化療后早期18F?FLT及18F?FDG攝取均與腫瘤細(xì)胞增殖活性呈正相關(guān)，即18F?FLT及18F?FDG攝取可以反映腫瘤治療后早期的細(xì)胞增殖活性的變化，是評(píng)價(jià)化療后早期療效的有效指標(biāo)。

不足之處在于本研究將臨床PET?CT應(yīng)用于小動(dòng)物，所得圖像清晰度欠佳，但是研究比較了PET?CT顯像測(cè)定腫瘤攝取T/NT與腫瘤組織實(shí)際攝取%ID/g的相關(guān)性，結(jié)果顯示它們之間有良好的正相關(guān)，表明通過PET?CT顯像所得T/NT可以反映小動(dòng)物腫瘤組織的實(shí)際攝取。

［1］Colozza M，Azambuja E，Cardoso F，et al.Proliferative markers as prognostic and predictive tools in early breast cancer：where are we?now?［J］.Ann Oncol，2005，16（11）：1723-1739.

［2］Shields AF，Grierson JR，Dohmen BM et al.Imaging proliferation in vivo with［F?18］FLT and positron emission tomography［J］.Nat Med，1998，4（11）：1334-1336.

［3］Grierson JR，Shields AF.Radiosynthesis of 3′?deoxy?3′?［18F］fluoro?thymidine：［18F］FLT for imaging of cellular proliferation in vivo［J］.Nucl Med Biol，2000，27（2）：143-156.

［4］Rasey JS，Grierson JR，Wiens LW，et al.Validation of FLT uptake as a measure of thymidine kinase?1 activity in A549 carcinoma cells［J］.J Nucl Med，2002，438（9）：1210-1217.

［5］Buck AK，Halter G，Schirrmeister H，et al.Imaging proliferation in lung tumors with PET：18F?FLT versus18F?FDG［J］.J Nucl Med，2003，44（9）：1432-1434.

［6］Mier W，Haberkorn U，Eisenhut M.［18F］FLT：portrait of a prolifera?tion marker［J］.Eur J Nucl Med，2002，29（2）：165-169.

［7］Shields AF.Positron emission tomography measurement of tumour metabolism and growth：its expanding role in oncology［J］.Mol Im?aging Biol，2006，8（3）：141-150.

［8］Yamamoto Y，Nishiyama Y，Ishikawa S，et al.Correlation of18F?FLT and18F?FDG uptake on PET with Ki?67 immunohistochemistry in non ?small cell lung cancer［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2007，34（10）：1610-1616.

［9］Munch?Petersen B，Cloos L，Jensen HK，et al.Human thymidine ki?nase 1，regulation in normal and malignant cells［J］.Adv Enzyme Regul，1995，35：69-89.

［10］Boothman DA，Davis TW，Sahijdak WM.Enhanced expression of thymidine kinase in human cells following ionizing radiation［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1994，30（2）：391-398.

［11］Kauffman MG，Kelly TJ.Cell cycle regulation of thymidine kinase：residues near the carboxyl terminus are essential for the specific degradation of the enzyme at mitosis［J］.Mol Cell Biol，1991，11（5）：2538-2546.

［12］Cole PD，Smith AK，Kamen BA.Osteosarcoma cells，resistant to methotrexate due to nucleoside and nucleobase salvage，are sensi?tive to nucleoside analogs［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2002，50（2）：111-116.

［13］Dittmann H，Dohmen BM，Kehlbach G，et al.Early changes in18F?FLT uptake after chemotherapy：an experimental study［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2002，29（11）：1462-1469.

［14］Dittmann H，Dohmen BM，Paulsen F，et al.［18F］FLT PET for diag?nosis and staging of thoracic tumours［J］.Eur J Nucl Med Mol Im?aging，2003，30（10）：1407-1412.