不同濃度臭氧對大鼠離體腦片氧糖剝奪及再灌注損傷模型的保護作用

師存?zhèn)ィ磿赠i，冶占福，宋濤

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，西寧 810001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院疼痛科，沈陽 110001）

腦梗死是臨床常見的、嚴重危害人類健康的腦血管疾病，其發(fā)病率約占腦血管病的75%，病死率平均10%～15%，致殘率高且易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后死亡率大幅度增加［1］。通常顱內(nèi)動脈血管堵塞5～10 min就可以引起不可逆性神經(jīng)細胞壞死，形成“核心區(qū)”，而其周邊組織則處于缺血狀態(tài)，存在不同程度的水腫，細胞尚未發(fā)生不可逆性壞死，CT檢查表現(xiàn)為“半影區(qū)”，又稱“半暗帶”，這部分組織存在缺血—再灌注損傷的風(fēng)險，是治療的關(guān)鍵點，不恰當?shù)闹委熆赡芤l(fā)“遲發(fā)性神經(jīng)元死亡”而影響患者的預(yù)后［2，3］。目前研究顯示，腦缺血-再灌注損傷與自由基的生成、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細胞高度聚集和高能磷酸化合物耗盡等機制相關(guān)［4，5］。急性腦梗死的傳統(tǒng)治療包括溶栓、脫水、抗凝、降壓、營養(yǎng)神經(jīng)及使用糖皮質(zhì)激素等，這些方法從療效和安全性方面考慮仍存在著不足。上世紀80年代歐洲首先將臭氧引入臨床治療，在中樞及外周缺血性血管疾病的治療中取得了良好的效果［6］，但是尚缺乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

腦片培養(yǎng)是近年發(fā)展起來的一種器官培養(yǎng)方法［7，8］。為了明確臭氧對急性缺血性神經(jīng)組織損傷的作用，本研究擬采用大鼠離體大腦皮層腦片，建立氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）及復(fù)氧的神經(jīng)組織缺血?再灌注損傷模型，研究不同濃度臭氧對于大鼠離體神經(jīng)組織缺血-再灌注損傷的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑和器材

雄性SD大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部），共25只。體質(zhì)量250～300 g，于實驗前3 d領(lǐng)入實驗室適應(yīng)環(huán)境，每12 h晝-夜交替光照，室溫20℃。自由獲取食物和水。實驗試劑購自于Sigma?Aldrich公司（無錫），主要包括：三（羥甲基）氨基甲烷［Tris（hy?droxymethyl）aminomethane，Tris］、抗壞血酸、丙酮酸鈉、β?煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、還原型β?煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β?nicotinamide adenine dinu?cleotide reduced form，NADH）、谷氨酸（glutamate，Glu）、谷 氨 酸 脫 氫 酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、硫巴比妥酸。人工腦脊液（artifi cial cerebrospinal fluid，ACSF）成分：120 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.3 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L NaH2PO4，1.5 mmol/L CaCl2，26 mmol/L NaHCO3，11 mmol/L葡萄糖，pH值7.4，滲透壓285～290 mOsmol。4%人血清白蛋白（human serum albumin，HSA，美國 Equitech?Bio公司）；谷氨酸檢測試劑盒（BioVision，美國），器材主要包括：活組織切片機（英國Gomshall公司）、無菌插入式培養(yǎng)皿—Millicell?CM insert（上海Millipore）、MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、臭氧發(fā)生器（德國Hu?mares）、分光光度計（北京普析通用公司）。

1.2 制備腦片并建立模型

參照文獻［8，9］制備腦片并建立模型。大鼠在吸入安氟醚麻醉下迅速斷頭取腦，置入4℃ACSF保存，棄去小腦和腦干、分離雙側(cè)皮層，使用活組織切片機，沿冠狀面將皮層切開，制成350 μm厚度的切片。將制備好的腦片放入無菌插入式培養(yǎng)皿中，每孔內(nèi)預(yù)先加入2 mL ACSF液并放入2片腦片，將培養(yǎng)皿并放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，持續(xù)吹入95%O2+5%CO2的混合氣體60 min，該過程是為了修復(fù)切片所造成的損傷（恢復(fù)期）；在37℃繼續(xù)孵育30 min，使腦片與外部環(huán)境充分達到平衡（平衡期）；將培養(yǎng)液迅速更換成由混合氮氣（95%N2+5%CO2）預(yù)飽和的無葡萄糖ACSF孵育液（葡萄糖以等摩爾量的蔗糖代替），并持續(xù)吹入95%N2+5%CO230 min，使腦片處于缺糖缺氧狀態(tài)（OGD期）；OGD過程結(jié)束后，用新鮮的氧氣預(yù)飽和的含葡萄糖ACSF替代缺氧的溶液，繼續(xù)孵育90 min（再灌注期）。臭氧干預(yù)組是在再灌注過程中，分別向含和不含HAS（150 μg/mL）的ACSF液中持續(xù)加入不同濃度的臭氧和氧氣混合氣。整個實驗過程是序貫完成的（圖1）。

圖1 實驗程序Fig.1 Scheme of the study

1.3 實驗分組

將制備好的腦片隨機挑選分組，每組12片，共分為12組，對照組（CTRL）、模型組（OGD/R）及臭氧組，臭氧組依據(jù)干預(yù)條件不同分為10個亞組，具體包括：首先根據(jù)在再灌注期是否向ACSF中加入HSA，分成含HSA（TH）和不含HSA的組（T），再根據(jù)各自接受的不同濃度臭氧干預(yù)分為，10μg/mL組（TH1；T1）、20 μg/mL 組（TH2；T2）、30 μg/mL 組（TH3；T3）、40 μg/mL 組（TH4；T4）和 50 μg/mL 組（TH5；T5）。對照組全程處于恢復(fù)期狀態(tài)；模型組經(jīng)歷30 min OGD和90 min再灌注。

1.4 臭氧制備

利用高精度的醫(yī)用臭氧儀（德國HUMAZON公司）獲取臭氧，其濃度范圍為1～56 μg/mL，氣流量0～1 300 mL/min，最小可調(diào)節(jié)濃度為1 μg/mL。臭氧儀需要定期接受“碘量法”濃度校正檢測，以確保生成臭氧濃度的精確性。臭氧儀需要使用醫(yī)用氧氣而不是過濾空氣制備臭氧，因為在過濾空氣中存在78%的氮氣，并且能自動生成一氧化氮而干擾實驗。全程使用一次性的硅處理聚丙烯注射器（抗臭氧）和聚乙烯管路以確保臭氧含量和濃度的穩(wěn)定［10］。

1.5 神經(jīng)損傷的評估

參照文獻［11］，測量再灌注期內(nèi)ACSF中Glu和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量來評估神經(jīng)損傷的程度。利用試劑盒檢測谷氨酸濃度，試劑盒內(nèi)提供的谷氨酸混合酶試劑能夠特異性識別Glu為底物，成比例催化產(chǎn)生相應(yīng)顏色變化，因此Glu的含量可以用比色度法來測定，用組織濕重（nmol/mg）表示。

LDH作為細胞內(nèi)標志酶，是糖的無氧酵解和糖異生的重要酶系之一。當神經(jīng)元受損、膜通透性改變時，LDH漏出量明顯增加，是反映神經(jīng)細胞損傷的可靠生化指標，其含量可以利用紫外分光光度法測定樣本（腦片）在340 nm時吸收率下降的程度進行計算（U/mg組織濕重），在本研究中將該值與對照組進行比較，并以百分率表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臭氧對大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響

結(jié)果表明，對照組大鼠腦皮質(zhì)LDH釋放量為（2.24±0.22）U/mg，谷氨酸釋放量為（0.18±0.02）nmol/mg。經(jīng)歷30 min OGD和90 min再灌注后OGD/R組LDH和Glu釋放量明顯增加，分別為（8.31±0.21）U/mg和（0.66±0.04）nmol/mg，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＆lt;0.01）。臭氧20，30，40 μg/mL拮抗OGD后再灌注引起的LDH和Glu釋放，40 μg/mL臭氧有明顯的效應(yīng)，LDH和Glu釋放與OGD/R組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＆lt;0.01）。而低濃度（10，20，30 μg/mL）或高濃度（50 μg/mL）臭氧引起的LDH和Glu釋放與OGD/R組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＆gt;0.05），見表1。

表1 臭氧對大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響Tab.1 Effects of ozone on oxygen?glucose deprivation and reoxygenation?induced release of glutamate and LDH

2.2 HSA 在臭氧（30，40 μg/mL）作用下對大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響

結(jié)果表明，30，40 μg/mL的臭氧能夠明顯減少LDH和Glu釋放，其數(shù)值與對照組相當。LDH釋放量在含有HSA組（30，40 μg/mL臭氧）與不含HSA組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＆lt;0.05）。而Glu釋放量在含有HSA組（30 μg/mL臭氧）處理后下降，與不含HSA組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＆lt;0.05）。見表2。

表2 臭氧和HSA對大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響Tab.2 Effects of ozone and HSA on oxygen?glucose deprivation and reoxygenation?induced release of glutamate and LDH

3 討論

臭氧治療缺血性疾?。ㄏ轮珓用}硬化閉塞癥、視網(wǎng)膜中央動脈栓塞、急性腦梗死等）具有良好的療效［12，13］。

本研究結(jié)果表明大鼠腦片在經(jīng)歷OGD及再灌注損傷后，LDH與Glu的釋放明顯增加，給予不同濃度臭氧干預(yù)后表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，其中40 μg/mL臭氧具有最明顯的抑制效應(yīng)，而低濃度（10～30 μg/mL）或高濃度（50 μg/mL）臭氧都沒有引起明顯的效應(yīng)。臭氧的拮抗作用表現(xiàn)出倒置的“U型”濃度-效應(yīng)曲線規(guī)律，這與以往的研究一致［14］。

本研究結(jié)果還表明，在ACSF中加入HSA能明顯提高臭氧的拮抗效應(yīng)，這提示臭氧的作用不僅僅是簡單的物理溶解效應(yīng)，而是與周圍介質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。相關(guān)研究顯示［13］用95%氧氣與5%臭氧混合氣處理人血液，氧氣僅僅使血漿含氧量增加以及血紅蛋白發(fā)生充分氧合，而臭氧的作用類似于前體藥物，在血漿的液體環(huán)境中臭氧的溶解速度和擴散程度比氧氣高，并且能與溶質(zhì)快速發(fā)生反應(yīng)，特別是與水溶性抗氧化劑（尿酸、維生素C、還原型谷胱甘肽等），這些物質(zhì)在ACSF中不存在，因此本研究可能只觀察到了臭氧的一部分作用，這是該離體實驗存在的不足之處，尚需要結(jié)合相關(guān)的在體研究完善對臭氧作用的認識。

另外，目前所使用的大鼠離體腦片OGD及再灌注損傷模型，理論上僅有切片表面或內(nèi)部表淺組織的表層才能正常利用ACSF，而深層組織似乎無法與外界環(huán)境充分溝通，但在實驗中我們卻觀察到該離體神經(jīng)組織對外界不同濃度的臭氧有很好的反應(yīng)性，這提示我們臭氧的作用可能不僅局限在表面接觸。通常，在含水環(huán)境里，臭氧能快速發(fā)生反應(yīng)生成H2O2和烯醛。臨床研究［13］顯示，使用40～50 μg/mL臭氧氣體可以在全血中獲得最佳的臭氧治療濃度，即在1 mL全血（大約600 μL血漿）中溶解的有效臭氧劑量為20～40 μg。因此可以推測離體的腦組織至少在一定程度上接觸20～40 μmol H2O2和亞微摩爾的烯醛。兩者能夠在腦組織中擴散并逆轉(zhuǎn)在“缺血”或OGD 30 min階段時所造成的損傷。在接受臭氧自體血治療的志愿患者中，合理的H2O2和烯醛濃度能激發(fā)許多有用的生化反應(yīng)，從而發(fā)揮治療作用［16］。

根據(jù)“U型”曲線效應(yīng)，臭氧對神經(jīng)的保護作用與濃度相關(guān)，具有典型的“毒物興奮效應(yīng)”特點［15］，即類似于“預(yù)處理反應(yīng)”，通過少量有害刺激，激發(fā)體內(nèi)潛在的防御和修復(fù)能力。許多藥物的濃度/效應(yīng)關(guān)系都表現(xiàn)為這種特異的內(nèi)在趨勢特點［14］。

綜上所述，在離體腦缺血模型中臭氧具有神經(jīng)保護作用，且與濃度密切相關(guān)，表現(xiàn)為倒置的“U型”濃度-效應(yīng)曲線。該研究結(jié)論為臭氧的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，但是，在臭氧具體作用機制方面尚需要進行更加深入、細致的研究。

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