應用組織芯片檢測Bmi-1及P16在膽管細胞癌中的表達及意義

高玉寶，李常恩 (.湖北十堰市丹江口市第一人民醫(yī)院普外科，湖北 十堰 44000;.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院甲狀腺乳腺血管外科，湖北 十堰 44000)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期調(diào)控異常有著非常密切的關(guān)系，與細胞調(diào)控異常相關(guān)的基因很多，如Caspase-3、Bcl-2/Bax、P53、Bmi-1、P16 等［1-2］。Bmi-1 是細胞周期中非常重的調(diào)節(jié)因子，其可以促進細胞的增殖、分化以及腫瘤細胞的形成［3-4］。而P16屬于細胞增殖、分化的負性調(diào)節(jié)因子，通過與周期蛋白D(Cyclin D)結(jié)合為復合物，阻止了細胞從G1期進入S期，抑制細胞的分裂。本研究采用免疫組織化學技術(shù)(SP法)檢測Bmi-1及P16基因在膽管細胞癌組織中的表達，探討其與膽管細胞癌的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本與主要試劑:由桂林泛譜生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的人膽管細胞癌芯片共4張，15×10點陣，每點直徑1.1 mm，4 μm厚，其中包括70例膽管細胞癌組織，5例癌旁組織，雙芯布陣。所有標本由臨床外科手術(shù)所切除的組織標本提供，切除的標本用10%的甲醛固定24～48 h。所獲得的膽管細胞癌芯片的患者中，男40例，女30例，年齡22～76，平均56.8歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。所有病例術(shù)前均未實施放療、化療。主要試劑:濃縮型兔抗人Bmi-1多克隆抗體、濃縮型鼠抗人P16蛋白多克隆抗體、羊抗兔/鼠生物素化二抗、免疫組織化學試劑盒為超敏即用型S-P通用型、多聚賴氨酸及DAB顯色試盒等均由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 檢測方法:用免疫組織化學SP法。將已知陽性的膽管細胞癌切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。試驗步驟按試劑盒說明書進行。具體步驟為:①組織切片為4 μm，二甲苯脫蠟，乙醇脫水;②抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復);③3%過氧化氫滴加，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性使用37℃濕盒孵育10 min;④以減少非特異性背景使用正常羊血清37℃濕盒孵育10 min;⑤然后分別滴加一抗;⑥滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復合物37℃濕盒孵育;⑦滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色;⑧蘇木素復染、水洗、1%鹽酸酒精分色、水洗、飽和碳酸鋰1分鐘、水洗;⑨95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢。

1.3 結(jié)果判定:采用多光譜成像系統(tǒng)(Olympus公司)對Bmi-1及P16蛋白的表達進行定量分析，將每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積)。Bmi-1、P16蛋白是以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1的表達:可見膽管細胞癌組織中分布棕黃色顆粒較為密集，主要位于細胞核內(nèi)，見圖1;而癌旁組織中僅可見少量的棕黃色顆粒，至未見，Bmi-1表達弱或無表達，見圖2，經(jīng)圖像分析，Bmi-1在膽管細胞癌組織中的平均光密度為0.295 7±0.008 9，而癌旁組織中Bmi-1平均光密度為0.068 1±0.001 9;Bmi-1在膽管細胞癌組織中陽性面積率為0.2873±0.0087，癌旁組織中Bmi-1的陽性面積率為0.066 4±0.001 8。經(jīng)統(tǒng)計學分析膽管細胞癌組與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 Bmi-1膽管細胞癌組織中的表達(SP×200)

圖2 Bmi-1癌旁組織中的表達(SP×200)

表1 膽管細胞癌與癌旁組織中Bmi-1表達(±s)

表1 膽管細胞癌與癌旁組織中Bmi-1表達(±s)

注:膽管細胞癌與癌旁組織比較:①P＜0.05

組別 例數(shù) 平均光密度 陽性面積率膽管細胞癌 70 0.295 7±0.008 9① 0.287 3±0.008 7①癌旁組織 5 0.068 1±0.001 9 0.066 4±0.001 8 t值 56.747 9 56.348 0 P值0.000 0 0.000 0

2.2 P16蛋白的表達:在顯微鏡下觀察可見膽管細胞癌組織中有少量的棕黃色顆粒，有些膽管上皮中甚至未見棕黃色的陽性顆粒，P16蛋白表達弱或無表達，見圖3;而癌旁組織中在顯微鏡下觀察時細胞內(nèi)分布著一些密集而且染色較深的棕黃色顆粒，P16蛋白呈陽性，主要位于細胞核內(nèi)，見圖4。經(jīng)圖像分析，P16蛋白在膽管細胞癌組織中的平均光密度為0.058 9±0.001 6，而癌旁組織中平均光密度為0.257 1±0.008 4;P16蛋白在膽管細胞癌組織中陽性面積率為0.058 0±0.001 7，癌旁組織中 P16蛋白的陽性面積率為0.284 3±0.008 8。經(jīng)統(tǒng)計學分析膽管細胞癌組與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 膽管細胞癌與癌旁組織中Bmi-1表達

圖3 P16蛋白膽管細胞癌組織中的表達(SP×200)

圖4 P16蛋白癌旁組織中的表達(SP×200)

3 討論

膽管細胞癌屬于原發(fā)性肝癌，指發(fā)生于二級膽管以上的膽管上皮腫瘤，多見于男性。在我國，原發(fā)性肝癌中占約5%，近年來發(fā)病率逐年上升［5］。臨床癥狀多不明顯，周圍型膽管癌早期無癥狀，晚期可有上腹不適、肝大、體重下降等;肝門型膽管細胞癌常以黃疸為初發(fā)癥狀。一般發(fā)現(xiàn)多為晚期，手術(shù)切除率低，預后極差。隨著分子醫(yī)學的發(fā)展，以期通過選擇性抑制等方法來防治膽管細胞癌。Bmi-1基因?qū)儆赑cG(polycomb group gene，多梳基因)，其蛋白是重要的抑制轉(zhuǎn)錄因子之一，其可促進細胞增長，減少細胞凋亡。研究表明，PcG通過對細胞周期的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用［6-8］。Bmi-1蛋白在細胞核與染色質(zhì)結(jié)合，抑制INK4a-ARF，調(diào)低INK4a-p16和ARF-P19產(chǎn)生，降低INK4a-p16對cyclinD-CDK4的抑制作用，促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，加速細胞的生長;同時因降低P19-ARF產(chǎn)生，增加P53降解，減少細胞的凋亡［6］。P16基因?qū)儆谝职┗颍涞鞍淄ㄟ^與CDK4(細胞周期蛋白依賴激酶)競爭性結(jié)合cyclin D1(細胞周期素D1)，從而阻止了細胞的增殖作用。研究表明，在一些腫瘤中，P16基因突變或者缺失［9-10］。

本研究中，通過免疫免疫組織化學方法在膽管細胞癌及癌旁組織芯片同時檢測Bmi-1及p16的表達情況，結(jié)果表明Bmi-1在膽管細胞癌組織中高表達，而在癌旁組織中低表達，甚至不表達，兩者之間差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.05);P16在膽管細胞癌組織中低表達，而癌旁中高表達，兩者在統(tǒng)計學上有明顯差異性。同時發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在膽管細胞癌組織中呈高表達，而P16蛋白在膽管細胞癌組織中呈低表達，且Bmi-1與P16蛋白的表達呈現(xiàn)負相關(guān)，由此推測Bmi-1可能通過對P16蛋白表達的負性調(diào)控，進而使細胞凋亡機制失常，引起細胞的異常增殖，但Bmi-1如何調(diào)節(jié)p16的表達，以及p16如何調(diào)節(jié)膽管細胞癌的發(fā)生發(fā)展，尚需在細胞水平進一步研究。

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