大黃牡丹湯含藥血清對LPS刺激的小鼠肺巨噬細胞TLR4和MyD88表達的影響

孫燕妮，承解靜，楊曉燕，楊 潔，王麗敏，劉 軍

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，上海200062)

膿毒癥是由各種不同病原體及其毒素侵入人體引起的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，重癥膿毒癥的病死率為28%～50%［1］。近年來，中醫(yī)藥對膿毒癥炎癥介質及其信號轉導途徑的作用成為重癥醫(yī)學的研究熱點。Toll樣受體4(TLR4)是G-桿菌脂多糖(LPS)的跨膜受體，目前以LPS-TLR4信號通路為靶點研究其作用的報道不多。2013年1～12月，我們觀察了大黃牡丹湯含藥血清(以下簡稱含藥血清)對LPS誘導的小鼠肺巨噬細胞TLR4及髓樣分化因子88(MyD88)表達的影響，探討含藥血清防治膿毒癥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 藥物與試劑:大黃牡丹湯［制備方法:取大黃12 g、牡丹3 g、桃仁9 g、冬瓜仁30 g、芒硝9 g;水煎3 次，時間分別為1.5、1 h 和45 min，合并煎煮液后過濾濃縮至高濃度(含生藥1.6 g/mL)、中濃度(含生藥 0.8 g/mL)、低濃度(含生藥 0.4 g/mL)，4℃冰箱保存］。LPS購自Sigma公司，TLR4、MyD88多克隆抗體購自Abcan公司，辣根過氧化物酶標記的Ig G購自 Santa cruz公司，Trizol和RTPCR Kit均購自大連TaKaRa生物工程公司。動物與細胞:雄性SD大鼠20只，體質量(250±20)g，由上海西普爾—必凱實驗動物中心提供，經(jīng)普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后備用。小鼠RAW 264.7巨噬細胞株購于中科院上海細胞學生物研究所，實驗時采用3～5代細胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機分為正常組及中藥高、中、低濃度組，每組5只。中藥高、中、低濃度組每天上午 9 時分別予 13.2、6.6 、3.3 g/kg的大黃牡丹湯灌胃，正常組以等量生理鹽水灌胃，均連續(xù)7 d。末次灌胃(灌藥前禁食不禁水12 h)2 h后心臟采血處死，離心后分離血清，合并同組含藥血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm 微孔濾膜除菌過濾后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞分組及干預 將RAW 264.7細胞以1×106個/mL的濃度接種于6孔板中，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，待細胞生長融合成單層后，棄去原培養(yǎng)基，PBS沖冼后分為空白組，模型組及含藥血清低、中、高濃度組，每組3個復孔?？瞻捉M加入DMEM培養(yǎng)基1 mL;模型組加入DMEM培養(yǎng)基1 mL+LPS 0.5 mL(5 μg/mL);含藥血清低濃度組加入含10%低濃度含藥血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL+LPS 0.5 mL;含藥血清中濃度組加入含10%中濃度含藥血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL+LPS 0.5 mL;含藥血清高濃度組加入含10%高濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL+LPS 0.5 mL。加藥后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別收集各組細胞及上清液。

1.2.3 觀察項目

1.2.3.1 TLR4、MyD88 mRNA 表達 采用半定量RT-PCR法。所有基因序列均從GenBank中獲取，引物用 Primer5.0軟件進行設計。Trizol法提取RAW 264.7細胞總RNA，分光光度計測定A260/A280值及其濃度后分別于-80℃保存。MgCl210 μL、dNTP 5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、AMV RTase 1 μL、AMV-optimized Taq 1 μL、RNA 模板 1 μg、目的基因上下游引物各 1 μL、GADPH 上下游引物各 1 μL，余以RNase free dH2O補足50 μL反應體系。50℃、30 min，94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、2.5 min，35 個循環(huán)，取 RT-PCR 產(chǎn)物20 μL 于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。采用Flour-S成像儀分析軟件測定積分光密度值(IOD值)。

1.2.3.2 TLR4、MyD88 蛋白表達 采用 Western blot法。收集細胞(1×106個/mL)，加入1×SDS上樣緩沖液裂解細胞，收集細胞蛋白樣品，采用BCA法檢測蛋白濃度;制備好的蛋白樣品置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白/泳道上樣，行SDS-PAGE電泳分離條帶，常規(guī)轉膜，封閉，TBS/T洗膜，與1∶500稀釋的TLR4、MyD88多克隆抗體4℃反應過夜，洗滌，二抗室溫下孵育1～2 h，洗滌后X線膠片曝光。圖片掃描保存，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析每個特異條帶的灰度值，計算 TLR4/Beta-actin、MyD88/Beta-actin值(相對表達量)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TLR4、MyD88 mRNA 表達 模型組 TLR4、MyD88 mRNA表達均顯著高于空白組;含藥血清中、高濃度組表達均顯著低于低濃度組及模型組，中、高濃度組間、低濃度組與模型組間表達均無統(tǒng)計學差異。見表1及圖1、2。

表1 各組 TLR4、MyD88 mRNA 表達(n=3，IOD 值，±s)

表1 各組 TLR4、MyD88 mRNA 表達(n=3，IOD 值，±s)

注:與空白組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，☆P ＜0.01;與含藥血清低濃度組比較，▲P＜0.01;與含藥血清中濃度組比較，△P＜0.01

TLR4 mRNA MyD88 mRNA空白組 0.331±0.064☆ 0.259±0.021組別☆模型組 0.870±0.062★ 0.776±0.067★含藥血清低濃度組 0.779±0.033★ 0.681±0.026★含藥血清中濃度組 0.575±0.047★☆▲ 0.483±0.026★☆▲含藥血清高濃度組 0.554±0.048★☆▲ 0.469±0.048★☆▲

2.2 TLR4、MyD88蛋白表達 含藥血清中、高濃度組TLR4、MyD88蛋白表達均顯著低于模型組及低濃度組，中、高濃度組間及低濃度組與模型組間無統(tǒng)計學差異。見表2及圖3、圖4。

圖1 各組TLR4 mRNA表達

圖2 各組MyD88 mRNA表達

表2 各組TLR4、MyD88蛋白表達(n=3，相對表達量， ±s)

表2 各組TLR4、MyD88蛋白表達(n=3，相對表達量， ±s)

注:與空白組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，☆P ＜0.01;與含藥血清低濃度組比較，▲P＜0.01;與含藥血清中濃度組比較，△P＜0.01

組別 TLR4蛋白表達 MyD88蛋白表達空白組 0.488±0.106☆ 0.362±0.181☆模型組 0.763±0.085★ 0.780±0.091★含藥血清低濃度組 0.715±0.082★ 0.740±0.118★含藥血清中濃度組 0.577±0.072★☆▲ 0.547±0.114★☆▲含藥血清高濃度組 0.568±0.067★☆▲ 0.535±0.128★☆▲

圖3 各組TLR4蛋白表達

圖4 各組MyD88蛋白表達

3 討論

嚴重感染時，病原菌在感染灶大量繁殖并侵入血流形成菌血癥，同時釋放外毒素及內毒素，后者作用于機體的內皮細胞、中性粒細胞、單核—巨噬細胞、激肽、內啡肽及補體、凝血等系統(tǒng)，誘發(fā)多種炎癥介質釋放，使機體發(fā)生炎癥反應。在超過50種的炎癥介質中，TNF-α、IL-1、IL-6是較為明確的促炎介質，而 IL-4、IL-10、IL-13 及 TGF-β1是較為明確的抗炎介質。炎癥反應過強及(或)與抗炎因子的平衡失調及免疫紊亂可導致SIRS發(fā)生并逐級放大乃至失控，最終發(fā)生嚴重膿毒癥及膿毒性休克［2］。近年來的動物實驗表明，TLR4表達量與前炎癥因子釋放量直接相關，且可通過調控其信號轉導通路調節(jié)免疫反應，影響膿毒癥的發(fā)展［3］;TLR4作為模式識別受體在自然免疫中發(fā)揮重要作用，可識別LPS［4］。研究發(fā)現(xiàn)，超過半數(shù)的膿毒癥為G-桿菌所致［5］。當細菌入血崩解釋放內毒素后，其主要成分細胞壁LPS與LPS結合蛋白(LBP)結合，然后通過CD14傳遞給TLR4/髓樣分化蛋白2(MD2)復合體，進一步誘導下游的信號轉導［6］。TLR4有兩條信號轉導通路，即MyD88依賴性反應通路和非MyD88依賴性反應通路。MyD88依賴性途徑中參與細胞內信號轉導的分子有MyD88、IL-1受體相關蛋白激酶、腫瘤壞死因子受體活化因子6等，最終激活NF-κB;而非MyD88的依賴性途徑中參與細胞內信號轉導的分子有Toll白介素受體相關調節(jié)因子接頭分子及Toll白介素受體相關調節(jié)因子等，導致干擾素等多種細胞因子的表達，觸發(fā)一系列瀑布樣炎癥反應，最終導致SIRS、MODS 的發(fā)生［7］。LPS 是 G-菌外膜的主要成分，是TLR4的特異性激動劑，不激動其他TLRs［8］，TLR4基因缺失或突變可以導致細胞對LPS的反應性嚴重缺失［9］。鑒此，本研究采用純化LPS作為TLR4激動劑刺激RAW264.7。

祖國醫(yī)學將膿毒癥歸為“外感熱病”范疇，針對其病因、病機提出“菌毒并治”的中西醫(yī)結合治療原則，總結了膿毒癥治療的“三證三法”，即血瘀證用活血化瘀法、毒熱證用清熱解毒法、急性虛證用扶正固本法［10］。大黃牡丹湯源于《金匱要略》，由大黃、芒硝、桃仁、丹皮、冬瓜仁組成，具有瀉熱破瘀、散結消腫之功效。方中大黃苦寒攻下，瀉熱逐瘀，蕩滌腸中濕熱瘀結之邪;丹皮苦辛微寒，能清熱涼血、活血散瘀，兩藥合用，瀉熱破瘀，共為君藥;芒硝咸寒，瀉熱導滯，軟堅散結，助大黃蕩滌實熱，使之速下;桃仁活血破瘀;合丹皮散熱消腫，共為臣藥;冬瓜仁甘寒滑利，清腸利濕，引濕熱從小便而去，是為佐藥。全方合瀉下、清熱、破瘀于一體，臨床上被廣泛用于急性闌尾炎、急性膽囊炎，急性胰腺炎，腹膜炎、急慢性盆腔炎等多種炎癥性疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)［11～13］，大黃牡丹湯能明顯降低急腹癥患者外周血內毒素含量，改善預后;能抑制LPS刺激的巨噬細胞過度分泌細胞因子IL-1和TNF-α，打斷細胞因子網(wǎng)絡的惡性循環(huán)，從而達到免疫調節(jié)作用;能調節(jié)SIRS炎癥反應與抗炎癥反應系統(tǒng)之間的平衡。本課題組以往證實，大黃牡丹湯可抑制膿毒癥肺損傷大鼠血清及肺組織中NF-κB表達;可下調促炎介質TNF-α、IL-6表達，上調抗炎介質IL-10表達，促進免疫平衡;還可抑制肺組織髓過氧化物酶活性，減輕肺組織病理改變，保護肺組織?，F(xiàn)代藥理學研究證實，大黃素的作用靶點是LPS受體復合物部位。大黃素抑制炎癥反應的機制有［14］:①抑制核因子 IκBa、IκKa 和IκKr的磷酸化從而抑制NF-κB的轉位，使LPS誘導的炎性因子的表達減少;②抑制MAPKs信號通路的活化，從而影響相關炎性因子的表達;③高劑量時還可抑制JNK的磷酸化。

本研究結果顯示，模型組TLR4、MyD88表達均顯著高于空白組，含藥血清中、高濃度組TLR4和MyD88表達均顯著低于模型組，證實抑制TLR4和下游MyD88表達是大黃牡丹湯治療膿毒癥的作用機制之一。

總之，針對G-細菌LPS引起的膿毒性休克可利用分子生物學手段在TLR4胞外段的不同水平阻斷Toll激活的信號傳遞，有望給內毒素休克的治療帶來突破。深入研究細胞信號轉導和基因轉錄水平干預LPS誘導的炎癥和損傷效應，提供新的靶點和治療措施，對于創(chuàng)傷、感染和多器官功能衰竭的研究具有重要意義。

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