高表達(dá)重組人組織激肽釋放酶7基因的前列腺癌單克隆細(xì)胞株的構(gòu)建

林志弟，莫林鍵，張成東，宣 強(qiáng)，張悅寧，莫曾南，滕若冰，楊小麗，

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院;2廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

前列腺癌是成年男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在美國(guó)其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，在我國(guó)其發(fā)病率逐年上升。重組人組織激肽釋放酶7基因(Kallikrein 7，KLK7)是人類組織激肽釋放酶基因家族的成員之一，編碼hK7蛋白。研究顯示該家族成員在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上升，可能為某些腫瘤的分子標(biāo)記物［1］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該基因在晚期前列腺癌組織中表達(dá)下降［2］。2012年3～9月，我們構(gòu)建了高表達(dá)KLK7的前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株，旨在為KLK7在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種、細(xì)胞、質(zhì)粒 TOP10感受態(tài)菌及pcDNA3.1克隆表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;人類前列腺癌細(xì)胞系DU145購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。構(gòu)建重組載體所需反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶與限制性內(nèi)切酶KpnⅠ購(gòu)自TaKaRa公司;LipofectamineTM2000、Trizol Reagent及 SOC 培養(yǎng)基為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;蛋白分子量Marker由賽百勝公司提供;PCR相關(guān)試劑為上海生物工程有限公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco公司;抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 人KLK7完整開(kāi)放讀碼框(ORF)擴(kuò)增 分離純化人正常前列腺組織上皮細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，行PCR擴(kuò)增。為提高蛋白的表達(dá)效率，引物中設(shè)計(jì)引入KOZAK系列。上游引物:5'-ACCATGGCAAGATC CCTTCTCC-3';下游引物:5'-TTAGCGATGCTTTTTCA TGGTGTC-3'。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 、5 min，1個(gè)循環(huán);95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃ 、1 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)765 bp。產(chǎn)物于1.7% 瓊脂糖膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3 真核表達(dá)載體構(gòu)建 選擇真核 pcDNA3.1表達(dá)載體。將PCR產(chǎn)物電泳后切膠純化，T4 DNA連接酶將產(chǎn)物與pcDNA3.1表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TOP10。應(yīng)用Amp抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，挑取白色菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，之后進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序得到的序列與NCBI公布的KLK7全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將DU145細(xì)胞置于內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按2×105個(gè)/孔密度種于24孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)使得次日細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～95%，按陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體(LipofectamineTM2000)操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后棄去舊培養(yǎng)液，消化細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，700 μg/mL G418進(jìn)行細(xì)胞篩選。設(shè)置空載體細(xì)胞作為對(duì)照。篩選出單克隆細(xì)胞后行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株KLK7表達(dá)測(cè)定 采用Western blot法。分別提取空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pcDNA3.1-KLK7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白，定量，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜;5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4℃搖床孵育過(guò)夜;TBS洗膜后二抗(1∶3 000)室溫1 h;再次洗膜，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA 3.1-KLK7載體結(jié)構(gòu) 載體酶切鑒定抽提質(zhì)粒，采用KpnI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，載體結(jié)構(gòu)如圖1。因 pcDNA3.1載體和KLK7開(kāi)放讀碼框上各有一個(gè)酶切位點(diǎn)，該酶在插入方向正確的重組表達(dá)載體電泳顯示切下的條帶為686 bp，與預(yù)期相符，見(jiàn)圖2。對(duì)符合預(yù)期的重裝質(zhì)粒DNA測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 pcDNA3.1-KLK7結(jié)構(gòu)及酶切位點(diǎn)位置示意圖

圖2 載體KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切電泳圖

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒DNA測(cè)序圖(部分)

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株KLK7表達(dá) 蛋白免疫印跡結(jié)果表明，空載體組細(xì)胞無(wú)目的條帶，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞有特異條帶，大小與文獻(xiàn)報(bào)道相符。說(shuō)明轉(zhuǎn)染的DU145成功表達(dá)hK7蛋白;而對(duì)照細(xì)胞不表達(dá)hK7。見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空載體細(xì)胞hK7表達(dá)比較

3 討論

KLK7編碼hK7蛋白;該家族分子結(jié)構(gòu)保守，均表達(dá)絲氨酸蛋白酶活性;目前共發(fā)現(xiàn)有15個(gè)成員，按發(fā)現(xiàn)先后記為KLK1～KLK15，相應(yīng)所編碼的蛋白為hK1～hK15［3］。hK7最早被發(fā)現(xiàn)在皮膚角質(zhì)層高表達(dá)，因其具有糜蛋白酶樣活性，最先被命名為角質(zhì)層糜蛋白酶(SCCE);hK7參與表皮脫屑相關(guān)的各種生理和病理過(guò)程，主要機(jī)制是降解角質(zhì)層細(xì)胞間的橋粒等胞間連接結(jié)構(gòu)從而造成細(xì)胞脫落。研究顯示這是一個(gè)有絲氨酸蛋白酶參與的蛋白水解過(guò)程［4，5］。

人體很多體液中有較高h(yuǎn)K7表達(dá)，如卵巢癌腹水、乳汁、唾液、精液、血清、滑膜液、男性尿液等［1］。近年的一些研究結(jié)果顯示hK7與某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性，如 hK7 在卵巢癌［6］、胰腺癌［7］、結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)［8］，而hK7在乳腺癌及前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)［9］;這些腫瘤有激素依賴性的，也有非激素依賴性的(多數(shù)KLKs表達(dá)受激素調(diào)控)。hK7已經(jīng)被認(rèn)為是卵巢癌及宮頸癌的潛在標(biāo)志物［10，11］。在腦腫瘤中，hK7 也與腦瘤細(xì)胞的惡性程度成正相關(guān)［12］。關(guān)于hK7在腫瘤中如何發(fā)揮作用，有研究認(rèn)為hK7可通過(guò)降解胞外基質(zhì)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞脫落及細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移［10，13］。其他的體外研究發(fā)現(xiàn)，hK7剪切E-鈣黏素分子產(chǎn)生的可溶性片段可以促進(jìn)胰腺腫瘤的轉(zhuǎn)移［14］。目前關(guān)于hK7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的確切作用模式尚不明確，較多學(xué)者認(rèn)為其與惡性病變相關(guān)。

本課題組前期的研究顯示，前列腺癌組織中KLK7表達(dá)較癌旁及前列腺增生細(xì)胞低，其作用機(jī)制尚不清楚［15］。為深入研究其功能，包括其參與的信號(hào)通路、對(duì)細(xì)胞的影響等，需要構(gòu)建高表達(dá)hK7蛋白的前列腺癌細(xì)胞株。本研究成功構(gòu)建了KLK7的真核表達(dá)載體，并獲得一系列表達(dá)量不同的穩(wěn)定細(xì)胞株，從中篩選出高表達(dá)株有助于進(jìn)一步的研究。

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