葛根素對大鼠顱腦損傷后ICAM－1和NF－κB表達的影響

馮納婷，馮雅碧

創(chuàng)傷性腦損傷 （traumatic brain injury，TBI）是神經外科最常見的疾病之一，局部組織的炎癥反應是繼發(fā)性腦損傷的重要因素［1］。研究表明，血管內皮表面的細胞間黏附分子 （ICAM－1）可以引起顱腦損傷后腦組織病理生理改變，大量中性粒細胞聚集和黏附于腦血管內皮并浸潤到損傷腦組織中［2，3］；核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB） 調控 B淋巴細胞免疫球蛋白κ輕鏈的基因轉錄，與機體的炎癥過程密切相關［3，4］。葛根素是一種天然多酚類化合物，結構類似雌二醇，具有某些雌激素樣作用。研究發(fā)現(xiàn)它是一種天然的抗氧化劑，可以清除各種氧自由基和抑制脂質過氧化，保護細胞膜的結構，從而具有抗氧化、降血壓、抗癌等多種藥理活性，目前研究表明它對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有一定的保護作用［5］。本試驗即通過建立大鼠顱腦損傷模型，給予葛根素治療后，運用分子生物學手段，分析腦組織中ICAM－1和NF－κB表達的變化，初步探討葛根素保護顱腦損傷后的分子機制，為葛根素的進一步研究和應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 丙二醛 （MDA） 和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。葛根素購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%。ICAM－1和 NF－κB 抗體購自 sigma公司；dNTP和TagDNA聚合酶購自Promega公司。成年健康SD大鼠15只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 建立大鼠顱腦損傷動物模型［6］，隨機分為假手術組、模型組和治療組，每組各5只。腹腔注射4%戊巴比妥鈉，沿中線左側切開頭皮，分離骨膜，保持完整硬膜，從高處撞擊硬膜，造成顱腦損傷。假手術組僅打開顱骨，不致腦損傷。模型組大鼠，給予生理鹽水處理；治療組大鼠，建立模型前預先口服灌胃50 μmol/L的葛根素7 d。

1.2.2 測定MDA含量和SOD活性 按試劑盒操作說明，通過TBA硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測SOD活性。

1.2.3 RT－PCR 實驗 收集各組大鼠腦組織，TRIZOL法提取細胞總mRNA。按照基因BANK序列設計合成引物（大連寶生物公司合成）。ICAM－1上游引物序列，5＇－GGTGGGCAAGAACCTCATCCT－3＇；下游引物序列，5＇－CTGGCGGCT CAGTGTCTCATT－3＇。NF－κB基因序列設計引物，由大連寶生物公司合成：5＇－TCAATGGCTACACAGGACCA －3＇；5＇－CACTGTCAC CTGGAACCAGA－3＇。β－actin 序列：5＇－ATCATGTT TGAGACCTTCAACA－3＇； 反義 5＇－CAT CTCTTGCT CGAAGTCCA－3＇。 RT－PCR 分析 ICAM－1 和 NF－κB mRNA 表達的變化：5 μl PCR 產物，加1 μl的loading buffer混勻，加入樣品孔內，電壓為5 V/cm，電泳 30 min，終止電泳。 0.5%溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像儀觀察圖像并計算灰度值。

1.2.4 Western blot實驗 收集各組大鼠腦組織，加入1 ml胞裂解緩沖液，機械勻漿，12000 r/min，離心30 min，收集上清。取各組蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠電泳，轉膜，5%的脫脂乳封閉非特異性染色，加 ICAM－1 和 NF－κB 一抗（1∶1000），孵育后加過氧化物酶標記的二抗，顯色，觀察結果。

2 結 果

2.1 各組SOD活性及MDA含量 表1結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠，SOD活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加（P＜0.05），提示模型組動物顱腦損傷明顯；經葛根素處理的治療組大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

注：與假手組相比，＊P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05

SOD（NU /mg） MDA（μmol/g）61.46±2.39 2.31±0.21 33.18±1.42＊ 4.64±0.11＊51.36±1.31＃ 2.93±0.3＃分組 n假手術組 5模型組 5治療組 5

2.2 葛根素對ICAM－1和NF－κB表達的影響RT－PCR結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA表達顯著升高（P＜0.05，n＝5），經葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA 表達顯著降低（P＜0.05，n＝5），結果見圖 1。

圖1 RT－PCR檢測ICAM－1和NF－κB的表達

Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著升高（P＜0.05，n＝5），經葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著降低（P＜0.05，n＝5），結果見圖 2。

圖2 Western blot檢測ICAM－1和NF－κB的表達

3 討 論

葛根素是一種多酚類化合物，屬植物雌激素類，具有很強的抗氧化活性。葛根素在4位和7位各有1個羥基，可與雌激素受體（ER）相結合，具有抗自由基損傷、擴張心血管、降低心肌耗氧、改善心肌代謝、抑制血小板活化與聚集等作用［7］。細胞間黏附因子－1（ICAM－1）廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)中，分為跨膜和可溶性蛋白兩種形式，可介導多種炎癥細胞黏附于血管內皮細胞，是多種炎性因子發(fā)揮作用的分子基礎［8，9］。 轉錄因子 NF－κB 主要存在于細胞質中，炎癥介質、氧化應激等刺激可激活NF－κB信號轉導通路，暴露NF－κB的DNA結合位點，發(fā)生核轉位，與細胞因子、黏附分子等的啟動子或增強子的特異性位點結合，啟動基因轉錄的過程［10，11］。創(chuàng)傷性腦損傷后，局部組織易發(fā)生炎癥反應，引起繼發(fā)性腦損傷。如何降低或減弱炎癥反應，避免繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生，保護受損的腦組織，降低高致殘率、病死率，是目前臨床研究中亟待解決的問題。

本研究中，通過建立大鼠顱腦損傷動物模型，經葛根素預處理后，分別觀察各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量的變化，結果提示，與假手術組比較，模型組大鼠SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（P＜0.05），而經葛根素處理的大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。RT－PCR和Western blot實驗分別觀察葛根素對ICAM－1和NF－κB mRNA及蛋白表達的影響，結果均顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著升高，經葛根素處理后，大鼠腦組織中NF－κB蛋白表達顯著降低。以上結果均提示，大鼠顱腦受到損傷后，局部組織炎癥反應顯著，炎癥相關指標均發(fā)生明顯的變化，而經葛根素預處理的大鼠，可以抑制或降低顱腦受到損傷后腦組織中局部炎癥反應，調控或影響ICAM－1和NF－κB分子的信號通路，起到腦保護的效應。

本實驗以多酚類化合物葛根素為研究對象，通過建立大鼠顱腦損傷動物模型，利用RT－PCR和Western blot等手段，分析和檢測大鼠腦組織中血管內皮表面的細胞間黏附分子－1（ICAM－1）和NF－κB的變化，初步探討葛根素影響顱腦損傷后相關因子表達的作用機制，為葛根素的進一步研究和應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。

［1］ Chen G， Shi JX， Hang CH.Inhibitory effect on cerebral inflammatory agents that accompany traumatic brain injury in a rat model：a potential neuroprotective mechanism of recombinant human erythropoietin（rhEPO）［J］.Neurosci Lett，2007，425（3）：177－82.

［2］ Briassoulis G，Papassotiriou I，Mavrikiou M.Longitudinal course and clinical significance of TGF－beta1， sL－ and sE－selectins and sICAM－1 levels during severe acute stress in children［J］.Clin Biochem，2007，40（5－6）：299－304.

［3］ Jin W， Wang H， Yan W.Disruption of Nrf2 enhances upregulation ofnuclearfactor－kappaB activity，proinflammatory cytokines，and intercellular adhesion molecule－1 in the brain after traumatic brain injury［J］.Mediators Inflamm，2008，72（5）：174.

［4］ Baldwin AS Jr.The NF－kappa B and I kappa B proteins：new discoveries and insights［J］.Ann Rev Immunol， 1996，14（6）：649.

［5］ Boue SM，Wiese TE，Nehls S，et al.Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens［J］.J Agric Food Chem，2003，51（8）：2193－9.

［6］ Wong DY，Krebsbach PH，Hollister SJ.Brain cortex regeneration affected by scaffold architectures［J］.J Neurosurg，2008，109（4）：715－22.

［7］ Chen G，Zhang J，Jiannong Y.Determination of puerarin，daidzein and rutin in Pueraria lobata（Wild） Ohwi by capillary electrophoresis with electrochemical detection［J］.J Chromatogr A，2001，923（1－2）：255－62.

［8］ Hofer S，Bopp C，Hoerner C，et al.Injury of the blood brain barrier and up－regulation of icam－1 in polymicrobial sepsis［J］.J Surg Res，2008，146（2）：276－81.

［9］ Nordal RA，Wong CS.Intercellular adhesion molecule－1 and blood－spinal cord barrier disruption in central nervous system radiation injury［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2004，63（5）：474－83.

［10］ Marion S，Mazzolini J，Herit F，et al.The NF－κB signaling protein Bcl10 regulates actin dynamics by controlling AP1 and OCRL－bearing vesicles［J］.Dev Cell，2012，23（5）：954－67.

［11］ Oh J，Kim SH，Ahn S，Lee CE.Suppressors of cytokine signaling promote Fas－induced apoptosis through downregulation of NF－κB and mitochondrial Bfl－1 in leukemic T cells［J］.J Immunol，2012，189（12）：5561－71.