快速高效提取并檢測(cè)銀杏內(nèi)酯的一種新方法＊

王 琳，朱 纓，吳紀(jì)凱

本研究旨在尋找一種快速簡便、適用于大生產(chǎn)的方法從銀杏葉中提取、分離、檢測(cè)銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯，為參銀復(fù)智制劑的研制提供幫助，也為制備銀杏葉提取物的研究者提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與原料 大孔吸附樹脂 D101、AB－8、D201、聚酰胺樹脂均為工業(yè)級(jí)，乙腈為色譜純（Merck公司），其他試劑均為分析純，水為Millipore超純水。

銀杏葉藥材由蘇州天靈中藥飲片公司提供，銀杏葉內(nèi)酯 A（GA）、銀杏葉內(nèi)酯 B（GB）、銀杏葉內(nèi)酯C（GC）和白果內(nèi)酯（BB）對(duì)照品購至 sigma公司，純度＞98%。

1.2 儀器 液相色譜儀為Waters Acquity UPLC system，包括二元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱、ELS檢測(cè)器以及Empower色譜工作站；W14M－2電子恒溫水浴鍋（sheldon manufacturing.Inc.）；RE200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士產(chǎn)）；ZK一2A型真空干燥器 （上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；CP225D電子天平（Sartorius 公司）；PB-10 型酸度計(jì)（Sartorius）；搖床（Labnet orbit LS）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 銀杏萜類內(nèi)酯的UPLC－ELS測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 根據(jù)前期正交試驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)［2］報(bào)道選擇以下方法提取銀杏葉內(nèi)的內(nèi)酯類成分：銀杏葉適當(dāng)粉碎，加入7倍量70%乙醇溶液回流提取2次，3 h/次，合并提取液，減壓回收乙醇，加適量水至3倍藥材量水沉，靜置，過濾，濃縮至一定體積，濃縮液低溫貯存待用。

分別吸取等量濃縮液按1 BV/h的流速上不同類型樹脂柱吸附，先用水洗2 h，取一定濃度的乙醇溶液，按1 BV/h洗脫，分別收集一個(gè)柱床體積的洗脫液，減壓濃縮后以甲醇定容，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.1 一般資料 選取2017年9月至2018年4月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的各類癌癥患者269例，其中男150例，女119例，年齡44～77歲；其中乳腺癌53例，肝癌 86例，肺癌87 例(小細(xì)胞肺癌41例，鱗癌17例，腺癌29例)，白血病43例，均經(jīng)病理診斷及其他手段確診且未經(jīng)放化療。選取肺部良性疾病患者57 例，年齡48～73歲，其中支氣管炎患者22例，慢性阻塞性肺疾病17例，肺炎18例，并排除其他嚴(yán)重系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤。另以同期30例健康體檢人員作為健康對(duì)照組，年齡22～28歲，經(jīng)證實(shí)均無心臟、肝、腎等其他系統(tǒng)疾病。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：waters BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm；流動(dòng)相：甲醇－四氫呋喃－水（25∶5∶70）；流速：0.3 ml/min；柱溫：30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）；漂移管溫度：80℃； 載氣：氮?dú)?；流速?.5 L/min；進(jìn)樣量：5 μl。

2.1.3 線性考察 取銀杏內(nèi)酯 A、B、C和白果內(nèi)酯對(duì)照品適量，甲醇溶解，精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，分別配制成不同濃度，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，分別重復(fù)3次。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖1 供試品（A）和對(duì)照品（B）的UPLC圖

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于 0、1、2、4、6、8、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C平均峰面積的RSD分別為2.7%、2.4%、1.9%和 2.0%（n＝6）， 表明供試品在 48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C平均峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、1.4%和1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2 銀杏萜類內(nèi)酯分離工藝研究 吸附樹脂的吸附性能與被吸附分子的極性、分子大小、吸附劑的極性、比表面積、孔徑大小等因素有關(guān)，而且吸附樹脂因其結(jié)構(gòu)和基團(tuán)不同，或者生產(chǎn)廠家不同，吸附能力也有所區(qū)別，為了分離、富集、純化銀杏葉中的萜類內(nèi)酯，筆者收集了部分國內(nèi)不同廠家不同型號(hào)的吸附樹脂，通過對(duì)銀杏葉萜類內(nèi)酯的吸附與分離性能的研究，篩選出較為理想的樹脂和分離工藝。

2.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理和再生 在吸附樹脂生產(chǎn)過程中一般均采用工業(yè)級(jí)原料，產(chǎn)品沒有經(jīng)過進(jìn)一步凈化處理，因此吸附樹脂內(nèi)部往往殘留少量單體、致孔劑和其他有機(jī)物雜質(zhì)，在產(chǎn)品貯存期間，為防止細(xì)菌、真菌的生長，有時(shí)加入堿等防腐劑［3］。因此，在樹脂使用之前，必須進(jìn)行預(yù)處理，以除去制備和貯存中引入的雜質(zhì)。一般預(yù)處理如下：吸附樹脂水合：吸附樹脂通常以濕態(tài)保存，如果暴露在空氣中，樹脂可能部分干燥失水。為使樹脂再度水合，應(yīng)把脫水的吸附樹脂充分浸泡，以便從孔中趕出空氣泡。浸泡之后，用水沖洗取代乙醇，水洗，以除去痕量的防腐劑和殘留的單體化合物。

當(dāng)樹脂的吸附能力降低或受嚴(yán)重污染時(shí)需對(duì)樹脂進(jìn)行強(qiáng)化再生，其方法是：在容器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的3%～5%鹽酸溶液浸泡2～4 h，然后進(jìn)行二次水淋洗，至接近中性。再用3～4倍樹脂體積同濃度的鹽酸溶液通柱，然后用二次水洗至接近中性；再用3%～5%的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，后用二次水清洗至pH值為中性，備用即可。取一定量的樹脂，用95%的乙醇溶液浸泡24 h，然后用乙醇洗滌，直到洗出液中加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇；然后依次用4%Na0H、5%HCL浸泡2～4 h，分別用蒸餾水洗至中性，備用。

2.2.2 吸附樹脂裝柱步驟 一般吸附柱由玻璃制成。在裝柱之前應(yīng)先在柱中加入一定量的水，然后將帶水的吸附樹脂漿液倒入柱中，一般按下列步驟進(jìn)行：①樹脂－水漿液加入已帶有定量水的吸附柱中；②把過量的水通過柱底放出，保持水面高于樹脂層面3 cm以上直到所有樹脂全部轉(zhuǎn)移到柱中。

2.2.3 吸附樹脂的選擇 分別稱取3 g處理好的AB－8、D101、D201、聚酰胺四種干大孔樹脂于 100 ml具塞三角瓶中，量取銀杏葉提取濃縮液50 ml置于恒溫?fù)u床中，25℃下以一定的速度振搖24 h后進(jìn)行過濾，參照2.1的條件制備供試品，測(cè)定GA、GB、GC和BB的峰面積，并代入相應(yīng)的線性方程計(jì)算吸附平衡后溶液中銀杏內(nèi)酯的濃度。根據(jù)以下公式計(jì)算吸附量。

將吸附平衡的樹脂立刻放入磨口三角瓶中，再振蕩24 h，然后再將樹脂濾出，測(cè)定洗脫液中GA、GB、GC和BB濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算解吸率。

吸附量＝（C0－C）×V/m（mg/g）

解吸率＝［V1C1/（C0－C）V］×100%

其中C0和C分別為樹脂吸附前后銀杏內(nèi)酯粗提物液中各類銀杏內(nèi)酯的濃度，C1為15%乙醇溶液解吸附后溶液中各類銀杏內(nèi)酯的濃度；V為銀杏內(nèi)酯粗提物液的體積 （50 ml），V1為洗脫液體積（200 ml）；m 為干樹脂質(zhì)量（3 g）。

表2 4種大孔樹脂對(duì)銀杏葉萜類內(nèi)酯的靜態(tài)吸附效果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：聚酰胺吸附樹脂對(duì)銀杏葉中萜類內(nèi)酯有較好的吸附作用，加之較高的解吸率（達(dá)到90%以上），能達(dá)到對(duì)銀杏葉中內(nèi)酯類物質(zhì)的富集純化作用。因此，筆者選用聚酰胺吸附樹脂進(jìn)行銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.4 洗脫劑及洗脫濃度的選擇 內(nèi)酯類化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶劑，考慮到甲醇的毒性和丙酮的揮發(fā)性及溶解性，本實(shí)驗(yàn)中采用乙醇－水為洗脫溶劑，對(duì)已吸附的樹脂按1 BV/h的流速上柱吸附，先用水洗2 h，再用不同濃度洗脫劑自上而下進(jìn)行洗脫，分別收集不同濃度的洗脫劑的洗脫液，真空干燥，測(cè)定萜類內(nèi)酯的總含量（銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的含量之和）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫劑濃度對(duì)銀杏內(nèi)酯含量的影響

通過實(shí)驗(yàn)可知，乙醇濃度在5%～10%基本上可以將內(nèi)酯洗脫下來，銀杏萜類內(nèi)酯有效部位的含量高，考慮到用5%乙醇溶液洗脫時(shí)需較大體積，故采用10%為洗脫溶劑。

2.2.5 洗脫劑用量的選擇 考慮到洗脫劑對(duì)分離效果的影響，筆者分別對(duì)10%的乙醇濃度，以1BV、2BV、3BV、4BV、5BV 進(jìn)行研究，結(jié)果見表 3。

表3 洗脫劑用量的影響

從理論上講，洗脫劑用量越多越好，能將吸附質(zhì)量解析下來，但過量的洗脫劑后處理帶來麻煩，起不到濃縮的效果，同時(shí)過量的溶劑會(huì)將銀杏葉內(nèi)的其他成分洗脫下來，降低銀杏萜類內(nèi)酯的純度，從表3可知2～3倍已能將內(nèi)酯洗脫下來。

2.2.6 最佳分離工藝條件的驗(yàn)證 最佳工藝條件為銀杏葉采用7倍70%乙醇溶液回流提取2次，3 h/次，合并提取液，減壓回收乙醇，加3倍量水，水沉，過濾，濃縮，然后上己處理好的聚酰胺樹脂，2倍水洗后，用2～3倍樹脂床體積10%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥，檢測(cè)含量，按此條件，試制3批，結(jié)果銀杏萜類內(nèi)酯的含量都在35%以上，有效部位得率在90%以上，與所用銀杏葉原料中有效成分含量成正相關(guān)。

由上可知，該項(xiàng)技術(shù)穩(wěn)定可靠，能夠較經(jīng)濟(jì)地達(dá)到銀杏萜內(nèi)酯的有效分離。

3 討 論

3.1 UPLC法測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)［4］與 HPLC法比較，UPLC－ELSD法在檢測(cè)銀杏葉萜類內(nèi)酯時(shí)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：超高分離度、超高速度、超高靈敏度。常規(guī)HPLC法測(cè)定銀杏時(shí)萜類內(nèi)酯的含量一般需要0.5～1 h的時(shí)間，樣品組分才能得到較好的分離；而采用UPLC法只需15 min就能得到更好的分離效果和分析結(jié)果。

3.2 樹脂分離的優(yōu)點(diǎn) UPLC法只采用一次柱分離，結(jié)晶純化即可連續(xù)制得純度達(dá)35%以上的銀杏萜類內(nèi)酯。工藝操作中只采用無毒試劑水和乙醇，對(duì)產(chǎn)品藥用提供了安全保障。由于采用的是可重復(fù)使用的大孔樹脂，使生產(chǎn)成本大大降低。本工藝簡便，采用有機(jī)試劑少。因此適用于中試及工業(yè)生產(chǎn)，為大規(guī)模開發(fā)銀杏萜內(nèi)酯藥品奠定了良好基礎(chǔ)。

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