石斛合劑對老年糖尿病大鼠GCK、GLUT-2的影響

劉 赟，施 紅，林心君，鄭曉玲，許 茜

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350122）

哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)四種己糖激酶同工酶，在肝臟中存在的是IV型，稱為葡萄糖激酶（GCK），是肝臟葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖步驟的限速酶［1］。GCK影響β細(xì)胞胰島素的合成和分泌，充當(dāng)刺激胰島素分泌的葡萄糖感受器，在維持體內(nèi)葡萄糖平衡中起到關(guān)鍵性的作用［2］。另外，有人提出糖尿病發(fā)病的“葡萄糖調(diào)定點(diǎn)”學(xué)說，認(rèn)為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2（GLUT-2）和GCK的缺陷使β細(xì)胞對細(xì)胞外的葡萄糖敏感性降低，即β細(xì)胞膜胰島素釋放的“調(diào)定點(diǎn)”提高了［3］。本研究通過檢測大鼠胰島細(xì)胞GCK、GLUT-2水平，探討石斛合劑（DC）治療糖尿病可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 石斛、黃芪、五味子、丹參、葛根、玄參等；二甲雙胍緩釋片。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級Wistar大鼠70只，6月齡，雌性，體重（250±30）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 樂康全微量血糖檢測儀及血糖試紙，武漢俊杰電子有限公司生物組織攤烤片機(jī)（JK-5型），德國Leica公司石蠟切片機(jī)（RM2245型），日立7180自動生化分析儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，隨機(jī)分為兩組：正常組15只、造模組55只。根據(jù)課題組前期工作研究，正常組給予基礎(chǔ)飼料（來自福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料（自備：糖15%，豬油10%，膽固醇4%，膽鹽0.3%，蛋黃粉10%，基礎(chǔ)飼料60.7%），持續(xù)喂養(yǎng)1年（自然死亡15只）。造模組腹腔注射低劑量的STZ（20mg/kg），3d后用微量血糖儀篩選出隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L者為成模，其余不成模大鼠腹腔注射低劑量的STZ（20mg/kg），3d后用微量血糖儀篩選出成模大鼠。將2次成模大鼠隨機(jī)分為模型組（12只）、石斛合劑低劑量組（12只）、石斛合劑高劑量組（12只）、二甲雙胍對照組（10只），石斛合劑低、高劑量組灌胃生藥含量分別為2.0g/mL、4.0g/mL。檢測血糖、GSP，取胰腺組織，免疫組化檢測GLUT-2、GCK。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 石斛合劑對大鼠血清血糖、GSP水平的影響

模型組血糖水平、GSP水平顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，石斛合劑低劑量組、高劑量血糖水平、GSP 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），二甲雙胍對照組血糖水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血糖、GSP水平的比較 （mmol/L，±s）

表1 大鼠血糖、GSP水平的比較 （mmol/L，±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別 n 血糖（己糖激酶法）血糖（血糖儀法） G S P水平正常組 9 5.352±0.181 5.450±0.2061.201±0.049模型組 12 19.224±1.8171） 21.450±2.1641） 1.875±0.8831）二甲雙胍對照組 10 15.568±0.3462） 16.681±0.6542） 1.667±0.068石斛合劑低劑量組 12 11.652±0.4923） 12.133±0.8983） 1.568±0.0422）石斛合劑高劑量組 12 8.478±0.3033） 9.000±0.5513） 1.427±0.0573）

2.2 石斛合劑對大鼠GCK水平的影響

正常組在胰島和腺泡可見到GCK陽性表達(dá)，胰島內(nèi)細(xì)胞染色較均勻且顏色較深，空泡較少；模型組胰島形態(tài)改變，邊界不清，在胰島和腺泡可見到GCK陽性表達(dá)，但島內(nèi)出現(xiàn)空泡，胰島內(nèi)細(xì)胞染色不均勻且顏色較淺，部分細(xì)胞核呈梭形，細(xì)胞形狀不規(guī)則；二甲雙胍對照組在胰島和腺泡可見到GCK陽性表達(dá)，島內(nèi)出現(xiàn)部分空泡，胰島內(nèi)染色不均勻，部分染色較深；低劑量組在胰島和腺泡可見到GCK陽性表達(dá)，染色較模型組深，島內(nèi)出現(xiàn)部分空泡；高劑量組胰島邊界清晰，在胰島和腺泡可見到GCK陽性表達(dá)，染色較模型組深，可見部分空泡。統(tǒng)計(jì)表明：模型組GCK陽性面積、積分光密度（IOD）顯著低于正常組（P＜0.01），高、低劑量組GCK 陽性面積、IOD 顯著高于模型組（P＜0.05）。結(jié)果見表 2、圖 1。

表2 大鼠胰島GCK面積、IOD的比較 （±s）

表2 大鼠胰島GCK面積、IOD的比較 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n 面積（像素） IOD正常組 9 2627.500±204.527 1874.000±357.660模型組 12 737.000±60.9291） 319.667±21.7941）二甲雙胍對照組 10 753.167±56.108 302.500±20.322石斛合劑低劑量組 12 1247.500±129.7602） 503.500±44.1992）石斛合劑高劑量組 12 1217.167±133.1032） 457.667±29.4472）

2.3 石斛合劑對大鼠GLUT-2水平的影響

正常組在胰島和腺泡可見到陽性表達(dá)，胰島內(nèi)細(xì)胞染色較均勻且顏色較深，空泡較少；模型組胰島形態(tài)改變，邊界不清，在胰島和腺泡可見到陽性表達(dá)，但島內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分細(xì)胞核呈梭形，細(xì)胞形狀不規(guī)則；二甲雙胍對照組在胰島和腺泡可見到陽性表達(dá)，胰島邊界不清，部分染色較深，部分細(xì)胞核呈梭形；低劑量組在胰島和腺泡可見到陽性表達(dá)，且染色較均勻，島內(nèi)出現(xiàn)部分空泡；高劑量組在胰島和腺泡可見到陽性表達(dá)，且染色較均勻，空泡較少。統(tǒng)計(jì)表明：模型組GLUT-2陽性面積、IOD顯著低于正常組（P＜0.01），低、高劑量組 GLUT-2陽性面積、IOD 顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表 3、圖2。

3 討論

圖1 胰腺GCK免疫組化

圖2 胰腺GLUT-2免疫組化

表3 大鼠胰島GLUT-2面積、IOD的比較 （±s）

表3 大鼠胰島GLUT-2面積、IOD的比較 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別 n 面積（像素） I O D正常組 913430.167±1687.8681665.000±148.657模型組 124666.333±772.1071） 421.833±46.4781）二甲雙胍對照組 103188.667±411.536 542.333±68.373石斛合劑低劑量組 129160.667±372.8082） 1425.500±208.6623）石斛合劑高劑量組 1214370.667±2886.4323） 1336.333±233.4753）

通過以往的研究發(fā)現(xiàn)，石斛合劑可降低血糖、提升大鼠GLP-1含量［4-5］。另有研究表明GLP-1能促進(jìn)胰腺轉(zhuǎn)錄因子及葡萄糖激酶（GK）、GLUT-2的基因表達(dá)，改善糖脂毒性對β細(xì)胞功能的影響，抑制β細(xì)胞凋亡［6］。高血糖可下調(diào)葡萄糖通過膜上的GlUT-2在β細(xì)胞中的表達(dá)，從而減少糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使胰島素分泌減少。

本實(shí)驗(yàn)用免疫組化方法檢測GCK，高、低劑量組GCK陽性面積及IOD顯著高于模型組，說明石斛合劑能保護(hù)胰島細(xì)胞，并促進(jìn)部分胰島細(xì)胞分泌GCK，從而起到一定的代償作用；高、低劑量組GLUT-2陽性面積、IOD顯著高于模型組，說明石斛合劑可以對胰島起到保護(hù)作用，減少胰島內(nèi)空泡的形成，從而更好地發(fā)揮其分泌的作用。綜上所述，石斛合劑的作用機(jī)制可能是促進(jìn)GCK和GLUT-2在胰腺的表達(dá)，從而達(dá)到治療糖尿病的目的。

［1］Matschinsky F M.Glucokinase，glucose homeostasis，and diabetes mellitus［J］.Curt Diab Rep，2005，5（3）：171-176.

［2］翁建甲，黃知敏.早發(fā)型糖尿病的研究進(jìn)展［J］.廣東醫(yī)學(xué)雜志，2003，24（2）：126-127.

［3］Gammeltoft S，Kahn C R.Hormone signaling via membanae receptors［M］∥Larry Jameson J，De Groot L J.Endocrinology.3rd.Philadelphia：Saunders，1955：17-65.

［4］施紅，林求誠，陳國強(qiáng)，等.石斛合劑對2型糖尿病的臨床療效觀察［J］.中藥新藥與臨床藥理，2002，13（6）：348-350.

［5］余文珍，施紅，鄭燕芳，等.石斛合劑對衰老糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影響［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，12（3）：196-199.

［6］Federici M，Hribal W，Perego L，et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of langerhans［J］.Diabetes，2001，50（6）：1290.