• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胃腸動力藥西沙比利對表達于HEK293細胞的人ether-a-go-go相關基因2通道的影響

    2014-12-02 04:33:22元沙沙黃海霞楊金奎
    首都醫(yī)科大學學報 2014年6期
    關鍵詞:沙比利去極化依賴性

    元沙沙 黃海霞 楊金奎*

    (1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京100730;3.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理與病理生理學系,北京100069;4.首都醫(yī)科大學代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室,北京100069)

    人ether-a-go-go相關基因(human ether-a-go-go related gene,hERG)編碼的離子通道稱為hERG通道,屬于電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channel,Kv)家族的一員。目前發(fā)現(xiàn)的hERG鉀通道家族共有 3 種亞型:hERG1,2,3,或稱 Kv11.1,2,3。三者在人體不同組織中表達量不同,發(fā)揮的作用也不同。其中hERG1是最早被克隆的hERG家族成員,主要表達于可興奮組織,如心肌、腦、垂體、胰腺。心肌快速激活的延遲整流鉀電流(rapidly activated delayed rectifier potassium current,IKr)主要參與心肌動作電位的復極化突變后導致外向復極鉀電流減少,QT間期延長,引發(fā)多型性室性心動過速、心源性暈厥和猝死,稱長 QT 綜合征(long-QT syndrome,LQTS)[1]。腦組織中hERG1,2,3均有表達,其中hERG1主要與神經(jīng)元興奮發(fā)放頻率的適應性有關[2]。Hardy等[3]研究發(fā)現(xiàn)在人的胰腺組織也有 hERG1,2,3表達,其中hERG1與維持靜息膜電位水平有關,既是胰島素分泌的負調(diào)節(jié)因素,又是胰高血糖素分泌的正調(diào)節(jié)因素。

    同是hERG通道家族成員,但hERG1,2,3電壓依賴性以及門控特性并不相同[4],其中 hERG1與hERG2特性相似,而與hERG3差異較大。目前對于hERG家族,尤其是hERG1的功能研究較多,而對于hERG2與hERG3亞型的功能研究較少。分析其原因是多數(shù)已知表達hERG1,2,3的組織(心臟、腦、胰腺)中,hERG1表達量要高于hERG2與hERG3,采用異源表達的方法只能從基因水平區(qū)分各亞型成員,但對于自身組織中表達的hERG1,2,3尚缺乏特異性抑制藥物來嚴格區(qū)分。現(xiàn)有的抑制劑如E-4031、Dofetilide,只能作為hERG家族的抑制劑,并不能區(qū)分亞型。胃腸動力藥西沙比利是治療胃腸功能紊亂癥的常用藥物,自1992年已有關于過量胃腸動力藥西沙比利可引發(fā)長QT綜合征和致命性室性心律失常的報道[5-7]出現(xiàn)。Mohammad等[8]根據(jù)這一現(xiàn)象,結合hERG1具有參與心肌動作電位的復極化的作用,提出了胃腸動力藥西沙比利是一種潛在的hERG(指hERG1)抑制劑的假設,通過在HEK293細胞上穩(wěn)定表達hERG1通道,并利用膜片鉗技術進行了驗證。但西沙比利對于hERG2是否也有抑制作用,國內(nèi)外尚未有報道。本研究初步探討了西沙比利對于hERG2通道電流的影響,希望為后續(xù)研究hERG2電流的特異性抑制劑提供一個可應用的穩(wěn)定模型。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HEK293細胞購買于協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫。完全培養(yǎng)基含高糖DMEM溶液(含L-谷氨酸,不含丙酮酸鈉),10% 胎牛血清,1% 青-鏈霉素,1% 丙酮酸鈉,0.25%胰蛋白酶均為美國Gibco公司生產(chǎn)。含目的基因hERG2 cDNA(Gene Bank編號AF311913)、標記基因GFP、啟動子SV40和CMV、抗氨芐基因的表達載體GV314購于上海吉凱基因公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。電極內(nèi)液成分包括:KCl 130 mmol/L,MgATP 5 mmol/L,MgCl21 mmol/L,EGTA 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L(用KOH調(diào)節(jié)pH 值至7.3);電極外液成分包括:NaCl 137 mmol/L,KCl 4 mmol/L,CaCl22 mmol/L,MgCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,Glucose 10 mmol/L(用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.4);西沙比利(Cisapride Monohydrate以下簡稱Cisapride,粉末狀,藥品純度≥98%,購于美國Sigma公司),用無水乙醇(純度≥99.7%,京純試劑)配置為10 mmol/L的存儲液,分裝于1 mL離心管中,于-20℃凍存,用時按實驗所需終濃度稀釋于電極外液中。無水乙醇終體積分數(shù)不超過0.01%,可認為對hERG無影響。MgATP、EGTA、HEPES、Glucose為美國Sigma公司生產(chǎn),其余未特殊注明者為國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2 儀器與設備

    膜片鉗放大器:EPC-10(德國HEKA公司);三維操縱儀:MP-285型(美國Sutter公司);倒置熒光顯微鏡:TE2000-U型(日本Nikon公司);電極拉制儀:Narishige Model PB-7(日本Narishige公司);玻璃微電極:BF150-110-10型(美國Sutter公司);數(shù)據(jù)采集軟件:Pulse8.8(德國 HEKA公司);數(shù)據(jù)轉換軟件:Minianalysis V6.02;數(shù)據(jù)分析軟件:pCLAMP9.2(美國Axon公司);數(shù)據(jù)處理與繪圖軟件:Origin8.0(美國Microcal公司)。

    1.3 實驗方法

    HEK293細胞置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中,72 h傳代1次。實驗所用細胞為10~40代之內(nèi)。采用攜帶目的基因hERG2 cDNA和標記基因GFP的表達載體GV314,該表達載體含有 SV40和CMV啟動子、抗氨芐基因。Lipofectamine 2000,轉染48~72 h后,用0.25%胰蛋白酶消化,收集細胞后用HEK293完全培養(yǎng)基重懸,分種于35 mm培養(yǎng)皿中,選取鏡下熒光較強的細胞進行全細胞膜片鉗記錄。

    膜片鉗實驗采用全細胞記錄模式。玻璃微電極在充灌電極內(nèi)液后測得電極電阻2.5~4.0 MΩ,符合全細胞記錄使用條件。高阻封接成功后電阻1~2 GΩ。采用負壓吸引方式破膜,破膜后電阻500~600 MΩ。實驗均在室溫25℃ ~28℃條件下完成。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    使用Origin 8.0和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 西沙比利對hERG2的時間依賴性電流和尾電流的影響

    將HEK293細胞膜電位鉗制在-80 mV、時長1 s,之后給予-60~+50 mV、時長3 s的系列去極化刺激,階躍為10 mV,可觀察到隨電壓升高呈現(xiàn)先升高后下降的時間依賴性電流(Step電流,通常測量去極化后期的穩(wěn)態(tài)值來代表),反映hEGR2通道的內(nèi)向整流性;之后恢復至測試電位-40 mV,時長3 s,引出尾電流,各電壓下尾電流峰值的大小反映了該電壓下通道開放的程度。比例尺縱軸代表電流幅度500 pA,橫軸代表時長1 s。在該刺激條件下,未轉染的HEK293細胞,只存在微弱的背景電流,不存在hERG2電流,詳見圖1A。用hERG2轉染HEK293細胞48~72 h,可記錄出典型的hERG2電流,時間依賴性電流和尾電流在+20 mV去極化刺激下達到最大值。之后加入西沙比利存儲液,使終濃度為1 μmol/L,5 min后再次記錄同一細胞,詳見圖1B。為排除細胞大小對實驗的影響,分別以各電壓下Step電流和尾電流的密度pA/pF對測試電壓作IStep-V曲線和ITail-V曲線,發(fā)現(xiàn)當測試電壓高于-20 mV后,西沙比利使單位面積上電流幅度下降差異有統(tǒng)計學意義,詳見圖1C、D。

    圖1 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的影響Fig.1 Effect of cisapride on human ERG2 channels expressed on HEK293 cells

    2.2 不同濃度西沙比利對hERG2尾電流的影響

    觀察西沙比利由低到高濃度對hERG2電流的影響,將實驗分為 6 組:對照組,0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L西沙比利組,給予鉗制電壓-80 mV,時長1 s;去極化至+20 mV,時長3 s;后復極化至-40 mV,時長3 s,記錄用藥前和用藥后2 min hERG2電流,詳見圖2A。a至 f分別為未加藥、加入0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L 西沙比利作用前和作用后2 min的hERG2電流,圖中比例尺縱軸代表電流幅度500 pA,橫軸代表時長1 s。被抑制電流占總電流的百分比=(I前-I后)/I前電流,即電流抑制率。本研究顯示隨著西沙比利濃度逐漸上升,平均抑制率也逐漸增加。10.0 μmol/L Cisapride作用2 min可完全 抑制hERG2電流,有效率達100%詳見圖2B。

    圖2 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的影響的濃度依賴性Fig.2 Concentration dependence of hERG2 channels blocked by cisapride

    2.3 時間因素對于西沙比利抑制hERG2尾電流作用的影響

    觀察時間因素對西沙比利抑制hERG2電流的影響,本實驗對照組浴池液中不加入西沙比利,記錄同一細胞2、4、6和8 min的hERG2電流。實驗組為浴池液中加入西沙比利,終濃度為1 μmol/L,記錄同一細胞加藥前和加藥后2、4、6和8 min的hERG2電流,詳見圖3A。說明西沙比利抑制hERG2電流的作用具有時間依賴性。分別以各電壓下尾電流峰值對測試電壓作ITail-V曲線,發(fā)現(xiàn)當電壓高于-20 mV后,隨時間增加,殘存尾電流逐漸減小,西沙比利抑制作用加強,8 min時hERG2電流被完全抑制,詳見圖3B。

    圖3 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的抑制的時間依賴性Fig.3 Time dependence of hERG2 channels blocked by cisapride expressed on HEK293 cells

    3 討論

    HERG通道屬于電壓依賴性鉀通道家族的一部分,但在電流特性方面相對較復雜,與傳統(tǒng)鉀通道特性不同。當膜電位去極化時被激活,幾乎同時又發(fā)生失活,在較高的去極化電壓下失活甚至比激活更快,使得通道電導反而減小,表現(xiàn)為內(nèi)向整流特性。當膜電位恢復極化狀態(tài)時,失活通道又可快速復活,復活過程比在較負膜電位下引起的去活發(fā)生更快,所以膜電位復極后可引發(fā)比時間依賴性電流更大的尾電流。

    關于hERG通道的電流特性,常用經(jīng)典的雙門控結構模型理論來解釋:hERG通道結構包括兩個獨立的通道門:一個胞內(nèi)的激活門和一個胞外的失活門[9]。失活門活動迅速,而激活門活動相對緩慢,二者以不同速率開放和關閉,配合運動,表現(xiàn)出不同的通道電流。當細胞膜處于靜息電位時,胞外的失活門開放,胞內(nèi)的激活門關閉,此時通道無電流。在去極化刺激下,激活門緩慢開放,鉀離子外流,出現(xiàn)隨電壓升高的外向電流,即激活;電壓繼續(xù)升高,失活門開始關閉,激活門仍然開放,電流不升反降,即失活。當撤除去極化電壓時,失活門迅速恢復開放狀態(tài),而激活門尚未關閉,此時出現(xiàn)一個大的電流,表示失活的移去(再激活,其大小反映了通道實際的開放程度)。隨后激活門緩慢關閉,進入緩慢的去活階段。

    目前已報道的hERG通道抑制劑主要有:E-4031[10-11]、多菲特利[12]、維拉帕米[13]等,均在不同程度上影響了該通道的門控特性,使通道的門控特性改變,造成電流幅度下降或完全消失。1997年,Mohammad等[8]根據(jù)過量西沙比利引發(fā)LQTs綜合征和致死性心律失常這一臨床現(xiàn)象,證實了西沙比利對于HEK293細胞中異源性表達的hERG1通道具有抑制作用,使hERG1外向輸送鉀離子的功能減弱。提示西沙比利是一種新型hERG通道阻滯劑。其抑制作用具有明顯的濃度依賴性和電壓依賴性,即西沙比利濃度越高,抑制作用越強,電壓越高,抑制作用越強。

    本研究中選取西沙比利濃度0.001~10.0 μmol/L,結果顯示低濃度(0.001 μmol/L)西沙比利即對hERG2通道具有抑制作用,高于1 μmol/L西沙比利可完全抑制hERG2電流。同濃度西沙比利作用下,hERG2的殘存電流隨時間延長而減弱。提示胃腸動力藥物西沙比利能抑制HEK293細胞上表達的hERG2電流,包括時間依賴性電流和尾電流,因此西沙比利不能作為特異性抑制劑來區(qū)分 hERG1與hERG2通道;這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。但抑制作用的具體機制以及西沙比利對hERG通道的激活、失活等門控動力學特性的影響尚待進一步研究。

    [1] Curran M E,Splawski I,Timothy K W,et al.A molecular basis for cardiac arrhythmia:HERG mutations cause long QT syndrome[J].Cell,1995,80(5):795-803.

    [2] Warmke W,Ganetzky B.A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(8):3438-3442.

    [3] Hardy A B,F(xiàn)ox J E,Giglou P R,et al.Characterization of Erg K+channels in α-and β-Cells of mouse and human islets[J].J Biol Chem,2009,284(44):30441-30452.

    [4] Einarsen K,Calloe K,Grunnet M,et al.Functional properties of human neuronal Kv11 channels[J].Pflugers Arch,2009,458(4):689-700.

    [5] Humphrev P P,Bunce K T.Tachycardia during cisapride treatment[J].BMJ,1992,305(6860):1019-1020.

    [6] Bran S,Murray W A,Hirsh I B,et al.Long QT syndrome during high-dose cisapride[J].Arch Intern Med,1995,155(7):765-768.

    [7] Wysowski D K,Bacsanyi J.Cisapride and fatal arrhythmia[J].N Engl J Med,1996,335(4):290-291.

    [8] Mohammad S,Zhou Z,Gong Q,et al.Blockage of the HERG human cardiac K+channel by the gastrointestinal prokinetic agent cisapride[J].Am J Physiol,1997,273(5 Pt 2):H2534-H2538.

    [9] Shibasaki T.Conductance and kinetics of delayed rectifierpotassium channels in nodal cells of the rabbit heart[J].J Physiol,1987,387:227-250.

    [10]Zhou Z,Gong Q,Ye B,et al.Properties of HERG channels stably expressed in HEK 293 cells studied at physiological temperature[J].Biophys J,1998,74(1):230-241.

    [11]Shi W,Wymore R S,Wang H S,et al.Identification of two nervous system-specific members of the erg potassium channel gene family[J].J Neurosc,1997,17(24):9423-9432.

    [12] Snyders D J,Chaudhary A.High affinity open channel block by dofetilide of HERG expressed in a human cell line[J].Mol Pharrnacol,1996,49(6):949-955.

    [13] Elmedyb P,Olesen S P,Grunnet M.Activation of ERG2 potassium channels by the diphenylurea NS1643[J].Neuropharmacology,2007,53(2):283-294.

    猜你喜歡
    沙比利去極化依賴性
    慢性萎縮性胃炎的治療中聯(lián)用莫沙比利,瑞巴派特的有效性效果分析
    健康護理(2022年3期)2022-05-26 02:27:49
    發(fā)電機定子繞組極化去極化測試系統(tǒng)設計
    大電機技術(2021年2期)2021-07-21 07:28:44
    電纜等溫松弛電流的時間特性與溫度特性研究
    絕緣材料(2020年9期)2020-09-28 06:46:40
    去極化氧化還原電位與游泳池水衛(wèi)生指標關系研究
    非等熵 Chaplygin氣體極限黎曼解關于擾動的依賴性
    關于N—敏感依賴性的迭代特性
    商情(2017年38期)2017-11-28 14:08:59
    N-月桂酰基谷氨酸鹽性能的pH依賴性
    舒適護理在面部激素依賴性皮炎中的應用
    去極化電流法對10kV電纜絕緣老化診斷的研究
    莫沙比利加谷維素治療功能性消化不良分析
    国产亚洲精品久久久com| 精品一区二区三卡| 亚洲欧美清纯卡通| 精品少妇久久久久久888优播| av一本久久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 草草在线视频免费看| 波多野结衣一区麻豆| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人免费观看视频高清| 夫妻性生交免费视频一级片| 成年人免费黄色播放视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产又爽黄色视频| 日韩电影二区| 国产午夜精品一二区理论片| 久久狼人影院| 999精品在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜老司机福利剧场| 毛片一级片免费看久久久久| 国产视频首页在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 日日撸夜夜添| 亚洲国产av新网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 午夜日本视频在线| 久久免费观看电影| a级毛片在线看网站| 日韩人妻精品一区2区三区| av播播在线观看一区| 久久国产精品大桥未久av| 久久人妻熟女aⅴ| 九九在线视频观看精品| 国产有黄有色有爽视频| 国产av码专区亚洲av| 精品熟女少妇av免费看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中文天堂在线官网| 久久久久久久久久久久大奶| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产熟女欧美一区二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产免费现黄频在线看| 九草在线视频观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人漫画全彩无遮挡| 天堂8中文在线网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜91福利影院| 国产精品熟女久久久久浪| 99香蕉大伊视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 桃花免费在线播放| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 视频在线观看一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 丝袜喷水一区| 三上悠亚av全集在线观看| 丝袜美足系列| 国产1区2区3区精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 丰满少妇做爰视频| 性色avwww在线观看| 在现免费观看毛片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 91精品伊人久久大香线蕉| 看免费av毛片| 中文字幕av电影在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久人妻精品一区果冻| 男女高潮啪啪啪动态图| 人人澡人人妻人| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 天美传媒精品一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久国产亚洲av麻豆专区| 嫩草影院入口| 国内精品宾馆在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久热久热在线精品观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产高清三级在线| 蜜桃在线观看..| 午夜免费男女啪啪视频观看| 不卡视频在线观看欧美| 欧美日韩综合久久久久久| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品国产三级专区第一集| 婷婷色综合大香蕉| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品一区二区在线不卡| 综合色丁香网| 午夜老司机福利剧场| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 九九爱精品视频在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 18禁国产床啪视频网站| 国产探花极品一区二区| 色94色欧美一区二区| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 大话2 男鬼变身卡| 这个男人来自地球电影免费观看 | 一级片'在线观看视频| 国产激情久久老熟女| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 天美传媒精品一区二区| 9191精品国产免费久久| 久久久久精品性色| 蜜桃国产av成人99| 日日啪夜夜爽| 国产av一区二区精品久久| 午夜福利,免费看| 色94色欧美一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 人妻 亚洲 视频| 午夜福利,免费看| 亚洲av电影在线进入| 纵有疾风起免费观看全集完整版| a级毛片在线看网站| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲内射少妇av| 午夜福利视频精品| 热99国产精品久久久久久7| 麻豆乱淫一区二区| 蜜桃国产av成人99| 男人舔女人的私密视频| 成人综合一区亚洲| 日韩在线高清观看一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 免费观看av网站的网址| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩欧美精品免费久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美成人午夜免费资源| 精品一区二区三卡| 久久亚洲国产成人精品v| 免费av不卡在线播放| 亚洲av中文av极速乱| 最新的欧美精品一区二区| 日本午夜av视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久人人爽人人爽人人片va| 日本爱情动作片www.在线观看| av天堂久久9| 日韩制服骚丝袜av| 久久久国产一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| a级毛片黄视频| 免费黄网站久久成人精品| 欧美97在线视频| 亚洲,欧美精品.| 久久女婷五月综合色啪小说| 中文天堂在线官网| 日本色播在线视频| 久久久久久伊人网av| 久久久久视频综合| 看免费av毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品国产av蜜桃| 一个人免费看片子| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲成色77777| 满18在线观看网站| 一区二区三区精品91| 成人国产av品久久久| 国产熟女欧美一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 捣出白浆h1v1| 日本免费在线观看一区| av在线观看视频网站免费| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品三级大全| 最后的刺客免费高清国语| 青春草国产在线视频| 亚洲伊人色综图| 午夜免费观看性视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 色哟哟·www| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 午夜福利影视在线免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产又爽黄色视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产色婷婷99| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产成人av激情在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 99久久人妻综合| 亚洲,欧美,日韩| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 老司机影院毛片| 看非洲黑人一级黄片| 一级毛片电影观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看 | 97精品久久久久久久久久精品| 黄色 视频免费看| 中国美白少妇内射xxxbb| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲伊人久久精品综合| 国产成人免费无遮挡视频| 999精品在线视频| 色5月婷婷丁香| 国产永久视频网站| 日本vs欧美在线观看视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 少妇熟女欧美另类| 成人综合一区亚洲| 99视频精品全部免费 在线| 99热国产这里只有精品6| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| www日本在线高清视频| 亚洲伊人色综图| 欧美日本中文国产一区发布| a级毛片在线看网站| 各种免费的搞黄视频| 一级毛片我不卡| 丝袜在线中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产乱来视频区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产不卡av网站在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 青春草国产在线视频| 免费人成在线观看视频色| 免费观看av网站的网址| 色吧在线观看| 国产av国产精品国产| 一级黄片播放器| 久久婷婷青草| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲经典国产精华液单| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人免费无遮挡视频| 18禁观看日本| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品无大码| 亚洲情色 制服丝袜| 秋霞在线观看毛片| 国产av一区二区精品久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品,欧美精品| 有码 亚洲区| 欧美精品亚洲一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 各种免费的搞黄视频| 一本大道久久a久久精品| 丝袜喷水一区| 99国产综合亚洲精品| 色吧在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲av成人精品一二三区| 成人无遮挡网站| videos熟女内射| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产成人精品在线电影| 五月伊人婷婷丁香| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久久人妻| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 国产高清国产精品国产三级| 色视频在线一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 老司机影院毛片| 午夜免费鲁丝| 午夜福利,免费看| 最近的中文字幕免费完整| 中文字幕制服av| 国产成人精品在线电影| 草草在线视频免费看| 午夜老司机福利剧场| 国产在线一区二区三区精| 90打野战视频偷拍视频| 一级毛片 在线播放| 久久精品国产综合久久久 | 日本免费在线观看一区| 亚洲欧洲国产日韩| 91精品伊人久久大香线蕉| 伊人久久国产一区二区| 香蕉丝袜av| xxx大片免费视频| 9热在线视频观看99| 天天影视国产精品| 免费观看在线日韩| 女人精品久久久久毛片| 午夜老司机福利剧场| 男女午夜视频在线观看 | 国产1区2区3区精品| 国产精品蜜桃在线观看| 看免费成人av毛片| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 999精品在线视频| 九草在线视频观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99久久综合免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人亚洲欧美一区二区av| 女人精品久久久久毛片| 久久午夜福利片| 97在线人人人人妻| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久久久视频综合| 女性被躁到高潮视频| 少妇的逼水好多| 成人黄色视频免费在线看| av卡一久久| 成人综合一区亚洲| 蜜臀久久99精品久久宅男| 黄片播放在线免费| 久热久热在线精品观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美国产精品va在线观看不卡| 赤兔流量卡办理| 只有这里有精品99| 午夜福利视频精品| av黄色大香蕉| 国产有黄有色有爽视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产精品成人在线| 夫妻午夜视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 波多野结衣一区麻豆| 观看美女的网站| 国产精品久久久久久精品古装| av有码第一页| 99热网站在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费黄频网站在线观看国产| 日本黄大片高清| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 蜜桃在线观看..| 欧美日韩精品成人综合77777| 99九九在线精品视频| 精品一区二区三卡| 午夜免费观看性视频| 最新的欧美精品一区二区| 久久97久久精品| 国产色爽女视频免费观看| 中文天堂在线官网| 观看美女的网站| 十八禁高潮呻吟视频| 国产熟女欧美一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 在线免费观看不下载黄p国产| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产av影院在线观看| 曰老女人黄片| 久久久精品免费免费高清| 69精品国产乱码久久久| 亚洲成人手机| 国产高清三级在线| 亚洲av国产av综合av卡| 久久 成人 亚洲| 亚洲国产精品国产精品| 永久免费av网站大全| 午夜免费鲁丝| 少妇精品久久久久久久| a级毛片在线看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲精品一区蜜桃| 男女免费视频国产| 综合色丁香网| 十八禁高潮呻吟视频| av网站免费在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本91视频免费播放| 这个男人来自地球电影免费观看 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 男女国产视频网站| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 色视频在线一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| av播播在线观看一区| 精品久久久精品久久久| 色5月婷婷丁香| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 免费观看av网站的网址| 色视频在线一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本欧美视频一区| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品久久久久成人av| 国产探花极品一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品 国内视频| av国产久精品久网站免费入址| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色视频在线播放观看不卡| 岛国毛片在线播放| 夫妻午夜视频| 亚洲图色成人| 久久婷婷青草| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久综合国产亚洲精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| freevideosex欧美| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产成人精品一,二区| 日韩中字成人| 97精品久久久久久久久久精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 久久这里有精品视频免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产乱来视频区| 久久人妻熟女aⅴ| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99热国产这里只有精品6| 麻豆乱淫一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 天美传媒精品一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产麻豆69| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产av码专区亚洲av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日韩电影二区| 中国三级夫妇交换| 中文字幕制服av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 午夜福利视频精品| 欧美+日韩+精品| 欧美国产精品一级二级三级| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产av精品麻豆| 国产综合精华液| 久久久精品免费免费高清| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 乱人伦中国视频| 午夜av观看不卡| 免费黄色在线免费观看| 男女免费视频国产| 午夜老司机福利剧场| 岛国毛片在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 两个人免费观看高清视频| 日韩三级伦理在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人aa在线观看| 永久网站在线| 99九九在线精品视频| 免费大片黄手机在线观看| 两个人看的免费小视频| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品成人在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产免费福利视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 亚洲性久久影院| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | av黄色大香蕉| av福利片在线| 久久久精品区二区三区| 久久免费观看电影| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品久久久久成人av| 七月丁香在线播放| 曰老女人黄片| 永久免费av网站大全| 老司机影院成人| 国产成人精品久久久久久| av电影中文网址| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品一区二区在线不卡| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人精品婷婷| 在线观看一区二区三区激情| 女人精品久久久久毛片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 韩国高清视频一区二区三区| 一级片免费观看大全| 五月天丁香电影| 免费观看av网站的网址| 成人无遮挡网站| 免费av不卡在线播放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 制服人妻中文乱码| 久久久精品免费免费高清| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看人妻少妇| 草草在线视频免费看| 亚洲精品一区蜜桃| 少妇被粗大猛烈的视频| 三级国产精品片| 日韩av不卡免费在线播放| a 毛片基地| 男女免费视频国产| 日韩免费高清中文字幕av| av.在线天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品久久久久久久电影| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲成人av在线免费| 精品国产国语对白av| 亚洲经典国产精华液单| 性色avwww在线观看| 九九在线视频观看精品| 大片免费播放器 马上看| videosex国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人国语在线视频| 日本91视频免费播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲av男天堂| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 曰老女人黄片| 国产精品 国内视频| 五月天丁香电影| a级毛片在线看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| a级毛片在线看网站| 国产成人aa在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 最近的中文字幕免费完整| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 婷婷成人精品国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产乱来视频区| 国产黄频视频在线观看| 婷婷色av中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 91成人精品电影| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费在线观看黄色视频的| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲av在线观看美女高潮| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产深夜福利视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 午夜影院在线不卡| 多毛熟女@视频| 日韩成人伦理影院| 午夜免费鲁丝| 国产成人精品福利久久| 黄色毛片三级朝国网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 美国免费a级毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇 在线观看| 观看av在线不卡|