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    胃腸動力藥西沙比利對表達于HEK293細胞的人ether-a-go-go相關基因2通道的影響

    2014-12-02 04:33:22元沙沙黃海霞楊金奎
    首都醫(yī)科大學學報 2014年6期
    關鍵詞:沙比利去極化依賴性

    元沙沙 黃海霞 楊金奎*

    (1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京100730;3.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理與病理生理學系,北京100069;4.首都醫(yī)科大學代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室,北京100069)

    人ether-a-go-go相關基因(human ether-a-go-go related gene,hERG)編碼的離子通道稱為hERG通道,屬于電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channel,Kv)家族的一員。目前發(fā)現(xiàn)的hERG鉀通道家族共有 3 種亞型:hERG1,2,3,或稱 Kv11.1,2,3。三者在人體不同組織中表達量不同,發(fā)揮的作用也不同。其中hERG1是最早被克隆的hERG家族成員,主要表達于可興奮組織,如心肌、腦、垂體、胰腺。心肌快速激活的延遲整流鉀電流(rapidly activated delayed rectifier potassium current,IKr)主要參與心肌動作電位的復極化突變后導致外向復極鉀電流減少,QT間期延長,引發(fā)多型性室性心動過速、心源性暈厥和猝死,稱長 QT 綜合征(long-QT syndrome,LQTS)[1]。腦組織中hERG1,2,3均有表達,其中hERG1主要與神經(jīng)元興奮發(fā)放頻率的適應性有關[2]。Hardy等[3]研究發(fā)現(xiàn)在人的胰腺組織也有 hERG1,2,3表達,其中hERG1與維持靜息膜電位水平有關,既是胰島素分泌的負調(diào)節(jié)因素,又是胰高血糖素分泌的正調(diào)節(jié)因素。

    同是hERG通道家族成員,但hERG1,2,3電壓依賴性以及門控特性并不相同[4],其中 hERG1與hERG2特性相似,而與hERG3差異較大。目前對于hERG家族,尤其是hERG1的功能研究較多,而對于hERG2與hERG3亞型的功能研究較少。分析其原因是多數(shù)已知表達hERG1,2,3的組織(心臟、腦、胰腺)中,hERG1表達量要高于hERG2與hERG3,采用異源表達的方法只能從基因水平區(qū)分各亞型成員,但對于自身組織中表達的hERG1,2,3尚缺乏特異性抑制藥物來嚴格區(qū)分。現(xiàn)有的抑制劑如E-4031、Dofetilide,只能作為hERG家族的抑制劑,并不能區(qū)分亞型。胃腸動力藥西沙比利是治療胃腸功能紊亂癥的常用藥物,自1992年已有關于過量胃腸動力藥西沙比利可引發(fā)長QT綜合征和致命性室性心律失常的報道[5-7]出現(xiàn)。Mohammad等[8]根據(jù)這一現(xiàn)象,結合hERG1具有參與心肌動作電位的復極化的作用,提出了胃腸動力藥西沙比利是一種潛在的hERG(指hERG1)抑制劑的假設,通過在HEK293細胞上穩(wěn)定表達hERG1通道,并利用膜片鉗技術進行了驗證。但西沙比利對于hERG2是否也有抑制作用,國內(nèi)外尚未有報道。本研究初步探討了西沙比利對于hERG2通道電流的影響,希望為后續(xù)研究hERG2電流的特異性抑制劑提供一個可應用的穩(wěn)定模型。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HEK293細胞購買于協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫。完全培養(yǎng)基含高糖DMEM溶液(含L-谷氨酸,不含丙酮酸鈉),10% 胎牛血清,1% 青-鏈霉素,1% 丙酮酸鈉,0.25%胰蛋白酶均為美國Gibco公司生產(chǎn)。含目的基因hERG2 cDNA(Gene Bank編號AF311913)、標記基因GFP、啟動子SV40和CMV、抗氨芐基因的表達載體GV314購于上海吉凱基因公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。電極內(nèi)液成分包括:KCl 130 mmol/L,MgATP 5 mmol/L,MgCl21 mmol/L,EGTA 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L(用KOH調(diào)節(jié)pH 值至7.3);電極外液成分包括:NaCl 137 mmol/L,KCl 4 mmol/L,CaCl22 mmol/L,MgCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,Glucose 10 mmol/L(用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.4);西沙比利(Cisapride Monohydrate以下簡稱Cisapride,粉末狀,藥品純度≥98%,購于美國Sigma公司),用無水乙醇(純度≥99.7%,京純試劑)配置為10 mmol/L的存儲液,分裝于1 mL離心管中,于-20℃凍存,用時按實驗所需終濃度稀釋于電極外液中。無水乙醇終體積分數(shù)不超過0.01%,可認為對hERG無影響。MgATP、EGTA、HEPES、Glucose為美國Sigma公司生產(chǎn),其余未特殊注明者為國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2 儀器與設備

    膜片鉗放大器:EPC-10(德國HEKA公司);三維操縱儀:MP-285型(美國Sutter公司);倒置熒光顯微鏡:TE2000-U型(日本Nikon公司);電極拉制儀:Narishige Model PB-7(日本Narishige公司);玻璃微電極:BF150-110-10型(美國Sutter公司);數(shù)據(jù)采集軟件:Pulse8.8(德國 HEKA公司);數(shù)據(jù)轉換軟件:Minianalysis V6.02;數(shù)據(jù)分析軟件:pCLAMP9.2(美國Axon公司);數(shù)據(jù)處理與繪圖軟件:Origin8.0(美國Microcal公司)。

    1.3 實驗方法

    HEK293細胞置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中,72 h傳代1次。實驗所用細胞為10~40代之內(nèi)。采用攜帶目的基因hERG2 cDNA和標記基因GFP的表達載體GV314,該表達載體含有 SV40和CMV啟動子、抗氨芐基因。Lipofectamine 2000,轉染48~72 h后,用0.25%胰蛋白酶消化,收集細胞后用HEK293完全培養(yǎng)基重懸,分種于35 mm培養(yǎng)皿中,選取鏡下熒光較強的細胞進行全細胞膜片鉗記錄。

    膜片鉗實驗采用全細胞記錄模式。玻璃微電極在充灌電極內(nèi)液后測得電極電阻2.5~4.0 MΩ,符合全細胞記錄使用條件。高阻封接成功后電阻1~2 GΩ。采用負壓吸引方式破膜,破膜后電阻500~600 MΩ。實驗均在室溫25℃ ~28℃條件下完成。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    使用Origin 8.0和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 西沙比利對hERG2的時間依賴性電流和尾電流的影響

    將HEK293細胞膜電位鉗制在-80 mV、時長1 s,之后給予-60~+50 mV、時長3 s的系列去極化刺激,階躍為10 mV,可觀察到隨電壓升高呈現(xiàn)先升高后下降的時間依賴性電流(Step電流,通常測量去極化后期的穩(wěn)態(tài)值來代表),反映hEGR2通道的內(nèi)向整流性;之后恢復至測試電位-40 mV,時長3 s,引出尾電流,各電壓下尾電流峰值的大小反映了該電壓下通道開放的程度。比例尺縱軸代表電流幅度500 pA,橫軸代表時長1 s。在該刺激條件下,未轉染的HEK293細胞,只存在微弱的背景電流,不存在hERG2電流,詳見圖1A。用hERG2轉染HEK293細胞48~72 h,可記錄出典型的hERG2電流,時間依賴性電流和尾電流在+20 mV去極化刺激下達到最大值。之后加入西沙比利存儲液,使終濃度為1 μmol/L,5 min后再次記錄同一細胞,詳見圖1B。為排除細胞大小對實驗的影響,分別以各電壓下Step電流和尾電流的密度pA/pF對測試電壓作IStep-V曲線和ITail-V曲線,發(fā)現(xiàn)當測試電壓高于-20 mV后,西沙比利使單位面積上電流幅度下降差異有統(tǒng)計學意義,詳見圖1C、D。

    圖1 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的影響Fig.1 Effect of cisapride on human ERG2 channels expressed on HEK293 cells

    2.2 不同濃度西沙比利對hERG2尾電流的影響

    觀察西沙比利由低到高濃度對hERG2電流的影響,將實驗分為 6 組:對照組,0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L西沙比利組,給予鉗制電壓-80 mV,時長1 s;去極化至+20 mV,時長3 s;后復極化至-40 mV,時長3 s,記錄用藥前和用藥后2 min hERG2電流,詳見圖2A。a至 f分別為未加藥、加入0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L 西沙比利作用前和作用后2 min的hERG2電流,圖中比例尺縱軸代表電流幅度500 pA,橫軸代表時長1 s。被抑制電流占總電流的百分比=(I前-I后)/I前電流,即電流抑制率。本研究顯示隨著西沙比利濃度逐漸上升,平均抑制率也逐漸增加。10.0 μmol/L Cisapride作用2 min可完全 抑制hERG2電流,有效率達100%詳見圖2B。

    圖2 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的影響的濃度依賴性Fig.2 Concentration dependence of hERG2 channels blocked by cisapride

    2.3 時間因素對于西沙比利抑制hERG2尾電流作用的影響

    觀察時間因素對西沙比利抑制hERG2電流的影響,本實驗對照組浴池液中不加入西沙比利,記錄同一細胞2、4、6和8 min的hERG2電流。實驗組為浴池液中加入西沙比利,終濃度為1 μmol/L,記錄同一細胞加藥前和加藥后2、4、6和8 min的hERG2電流,詳見圖3A。說明西沙比利抑制hERG2電流的作用具有時間依賴性。分別以各電壓下尾電流峰值對測試電壓作ITail-V曲線,發(fā)現(xiàn)當電壓高于-20 mV后,隨時間增加,殘存尾電流逐漸減小,西沙比利抑制作用加強,8 min時hERG2電流被完全抑制,詳見圖3B。

    圖3 西沙比利對HEK293上表達的hERG2電流的抑制的時間依賴性Fig.3 Time dependence of hERG2 channels blocked by cisapride expressed on HEK293 cells

    3 討論

    HERG通道屬于電壓依賴性鉀通道家族的一部分,但在電流特性方面相對較復雜,與傳統(tǒng)鉀通道特性不同。當膜電位去極化時被激活,幾乎同時又發(fā)生失活,在較高的去極化電壓下失活甚至比激活更快,使得通道電導反而減小,表現(xiàn)為內(nèi)向整流特性。當膜電位恢復極化狀態(tài)時,失活通道又可快速復活,復活過程比在較負膜電位下引起的去活發(fā)生更快,所以膜電位復極后可引發(fā)比時間依賴性電流更大的尾電流。

    關于hERG通道的電流特性,常用經(jīng)典的雙門控結構模型理論來解釋:hERG通道結構包括兩個獨立的通道門:一個胞內(nèi)的激活門和一個胞外的失活門[9]。失活門活動迅速,而激活門活動相對緩慢,二者以不同速率開放和關閉,配合運動,表現(xiàn)出不同的通道電流。當細胞膜處于靜息電位時,胞外的失活門開放,胞內(nèi)的激活門關閉,此時通道無電流。在去極化刺激下,激活門緩慢開放,鉀離子外流,出現(xiàn)隨電壓升高的外向電流,即激活;電壓繼續(xù)升高,失活門開始關閉,激活門仍然開放,電流不升反降,即失活。當撤除去極化電壓時,失活門迅速恢復開放狀態(tài),而激活門尚未關閉,此時出現(xiàn)一個大的電流,表示失活的移去(再激活,其大小反映了通道實際的開放程度)。隨后激活門緩慢關閉,進入緩慢的去活階段。

    目前已報道的hERG通道抑制劑主要有:E-4031[10-11]、多菲特利[12]、維拉帕米[13]等,均在不同程度上影響了該通道的門控特性,使通道的門控特性改變,造成電流幅度下降或完全消失。1997年,Mohammad等[8]根據(jù)過量西沙比利引發(fā)LQTs綜合征和致死性心律失常這一臨床現(xiàn)象,證實了西沙比利對于HEK293細胞中異源性表達的hERG1通道具有抑制作用,使hERG1外向輸送鉀離子的功能減弱。提示西沙比利是一種新型hERG通道阻滯劑。其抑制作用具有明顯的濃度依賴性和電壓依賴性,即西沙比利濃度越高,抑制作用越強,電壓越高,抑制作用越強。

    本研究中選取西沙比利濃度0.001~10.0 μmol/L,結果顯示低濃度(0.001 μmol/L)西沙比利即對hERG2通道具有抑制作用,高于1 μmol/L西沙比利可完全抑制hERG2電流。同濃度西沙比利作用下,hERG2的殘存電流隨時間延長而減弱。提示胃腸動力藥物西沙比利能抑制HEK293細胞上表達的hERG2電流,包括時間依賴性電流和尾電流,因此西沙比利不能作為特異性抑制劑來區(qū)分 hERG1與hERG2通道;這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。但抑制作用的具體機制以及西沙比利對hERG通道的激活、失活等門控動力學特性的影響尚待進一步研究。

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