一例Kallmann綜合征患者雙基因突變分析

曹 曦 謝榮榮 信 中 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730)

特發(fā)性低促性腺激素型性腺功能減退綜合征又名Kallmann 綜合征(Kallmann syndrome，KS)，其特點是性腺功能低下，部分患者合并嗅覺障礙，先天性瞼中線或肢體畸形，是一種罕見的先天性疾病，國內(nèi)報道較少。

該疾病有家族性和散發(fā)性2種類型，其中散發(fā)性占60%左右［1］。其遺傳方式可以是X染色體連鎖的隱性遺傳、常染色體顯性和隱性遺傳［2-3］。目前為止，6個不同的基因已被確定與KS相關(guān):Kallmann syndrome 1(KAL)［4］，fibroblast growth factor receptor 1(FGFR1，也稱為 KAL2)［5］，F(xiàn)GF8［6］，prokineticin(PROK2)［7］，prokineticin receptor 2(PROKR2)［8］和 WDR11［9］。

已有的研究［10］顯示KS絕大多數(shù)是X連鎖隱性遺傳。一些KAL1基因異常(錯義突變，剪接位點突變，部分基因片段缺失和完整的基因缺失)已經(jīng)在大約10%的散發(fā)性患者和14%～50%的家族性患者中找到。KAL1基因組全長210 000，含有14個外顯子，編碼一種680個氨基酸的細胞外基質(zhì)蛋白，名叫嗅因子(anosmin-1)。KAL1基因編碼蛋白具有調(diào)控神經(jīng)軸突向外生長和識別靶組織或靶細胞的功能［4］，并且參與促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌神經(jīng)元和嗅覺神經(jīng)元的遷移［10］。

PROK2是一個含81個氨基酸的分泌蛋白，而PROKR2是一個含384個氨基酸的G偶聯(lián)受體蛋白。這兩個基因敲除小鼠模型顯示，它們在嗅球的形態(tài)和性成熟方面發(fā)揮著重要的作用［7］。

本研究利用聚合酶鏈式反應(yīng)和直接測序技術(shù)對一個 13歲 KS患者家系進行 KAL1、PROK2和PROKR2 3個基因突變分析，同時對其突變位點進行功能預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究獲得首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準，受試者充分了解研究內(nèi)容并簽署知情同意書。通過問卷調(diào)查獲得每個家庭成員一般基本情況和詳細的家族史。同時對內(nèi)分泌狀態(tài)、嗅覺功能和腎功能進行了臨床評估。

采用放射免疫分析法檢測激素水平，超聲掃描評估腹部結(jié)構(gòu)，腦部磁共振成像檢測嗅球、腦溝和內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)。

1.2 基因突變分析

本研究分別利用 SIFT［11］、Polyphen［12］和 Mutation Taster［13］3種生物信息學平臺進行了錯義位點和多態(tài)性位點的功能分析。

1.3 基因突變分析

抽取患者外周血2 mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。PCR擴增KAL1、PROK2和PROKR2 3個基因外顯子區(qū)，引物見表1。

表1 PCR引物序列及擴增片段長度Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含基因組DNA樣本200 ng、PCR mix 12.5 μL(北京天根生化科技有限公司)、10 μmol/L引物(北京諾賽基因合成)。在 PCR儀(BIO-RED)上完成擴增，PCR擴增循環(huán)條件如下:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán);最后于72℃延伸5 min，置于4℃保存。

擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳檢測目的片段大小。PCR產(chǎn)物直接送北京諾賽基因測序，測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast軟件比對分析。每個突變點經(jīng)過兩端測序確認，同時做3次獨立的PCR擴增驗證突變結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢查結(jié)果

患者為13歲的男孩，由于第二性征及外生殖器發(fā)育不良伴視力下降就診。與同齡人相比，患者身高和智力沒有明顯異常。11歲時，由于青春期發(fā)育不良進行了男性內(nèi)分泌功能評估，睪丸體積分別為0.65和0.56 mL。氣味測試揭示嗅覺減退。腹部超聲掃描顯示，膽囊、胰腺、脾、腎正常。MRI顯示嗅球、嗅束發(fā)育不良(圖1A)。

如表2所示，患者基礎(chǔ)血清雌激素(estradiol，E2)濃度，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，睪酮(testosterone，Testo)、皮質(zhì)醇(cortisol，F(xiàn))濃度顯著低于正常參考值。催乳素(prolactin，PRL)和孕酮(progesterone，PROG)濃度正常。

患者的母親有正常的青春期發(fā)育和月經(jīng)周期規(guī)律，血清促性腺激素和雌二醇的濃度正常，同時MRI結(jié)果顯示嗅球發(fā)育正常(圖1B)。其父親男性化特征明顯，血清促性腺激素和睪酮的濃度正常。

圖1 患者及其母親磁共振結(jié)果Fig.1 MRI findings of the patient and his mother

表2 患者內(nèi)分泌檢測結(jié)果Tab.2 Endocrine test results of the patient

2.2 基因突變篩查結(jié)果

如表3所示，患者KAL1基因測序存在2個新突變，這2個突變處于KAL1第12個外顯子上(I565T和S570T)(圖2B，C)，位于KAL1蛋白的第4個Ⅲ型纖連素樣(fibronectin typeⅢ domain，F(xiàn)nⅢ)重復序列結(jié)構(gòu)域(圖2A)。此外，測序還找到了5個KAL1基因單核苷酸多態(tài)性位點:V534I、V560F、G567S、K666M 和R668H。

值得一提的是，PROKR2基因測序發(fā)現(xiàn)核苷酸337位置T突變?yōu)镃，導致113位氨基酸位點由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸(p.Y113H)(圖2D)。同時在患者父母基因組中也找到該位點的雜合突變形式(圖2E)。

圖2 KAL1和PROKR2突變位點突變及測序圖Fig.2 Mutation map and partial nucleotide sequence of KAL1 and PROKR2 gene

2.3 功能缺失分析

3種分析方法都顯示 KAL1的 I565T位點和PROKR2的Y113H位點可能是對蛋白功能產(chǎn)生危害的突變位點(表3)。

表3 KAL1和PROKR2基因突變分析Tab.3 Summary of molecular analysis of the KAL1 and PROKR2 gene

此外，兩兩分析發(fā)現(xiàn)，Polyphen和Mutation Taster分析顯示G567S和S570T 2個位點也可能是對蛋白功能產(chǎn)生危害的突變位點?？紤]到G567S是一個SNP位點，S570T作為一個可能的致病位點的可能性比較大。最后總結(jié)3種分析方法和兩兩分析結(jié)果，I565T、S570T和Y113H(PROKR2)3個位點可能是該患者的致病基因位點。

3 討論

本研究在一個13歲KS患者KAL1基因中找到2個新的突變位點(I565T和S570T)和5個SNP位點(V534I、V560F、G567S、K666M 和 R668H)，同時在PROKR2基因中找到一個純合的錯義突變位點(Y113H)。這是在中國人群中發(fā)現(xiàn)的第1例KAL1和PROKR2 2個基因同時突變的KS患者。

已有的研究［14］顯示KAL1基因突變位點大多數(shù)位于第4個FnⅢ重復序列結(jié)構(gòu)域。本研究的2個新突變位點就位于KAL1蛋白第4個FnⅢ結(jié)構(gòu)域。FnⅢ結(jié)構(gòu)域與細胞黏附分子(CAM)家族成員:纖連蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子(NCAM)、L1和tenasin有著顯著的同源性［14］。這些分子通常與神經(jīng)元發(fā)育過程中細胞外和細胞間的相互黏附、增生和遷移作用相關(guān)，這表明anosmin-1也與這些細胞活動有關(guān)。此外，已有研究［14］顯示anosmin-1通過FnⅢ結(jié)構(gòu)域直接與FGFR1蛋白結(jié)合。綜合上述分析，KAL1的I565T和S570T 2個突變位點很可能是致病位點。

此外，患者KAL1基因中的5個SNP位點也值得注意。正如在2型糖尿病、遺傳性橢圓形紅細胞增多癥、克雅病和類風濕性關(guān)節(jié)炎等研究［15-16］中已經(jīng)證實，多個SNP位點增加了這些疾病的發(fā)病風險。KAL1多個SNP位點在患者基因組中的同時存在，也有可能是增加其患病概率的一個重要因素。

分析PROKR2的蛋白結(jié)構(gòu)，Y113H突變位點位于其第一個細胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)。本研究的功能預(yù)測分析顯示Y113H突變位點很可能為患者的致病位點。而已有研究［17］也證實，含有Y113H突變位點的PROKR2蛋白，在Egr1-LUC基因轉(zhuǎn)錄分析和基于水母的Ca2+流分析實驗中，其活性嚴重受損。這表明Y113H突變是PROKR2蛋白一個重要的功能缺失突變。

KS最初被認為是單基因遺傳性疾病，但是后來陸續(xù)被證實有多個基因起作用［18-19］。目前為止，報道有3例雙基因遺傳的KS患者，1例是FGFR1和NELF基因突變，另2例是KAL1和 PROKR2基因突變［20］，本研究是第4例。KAL1編碼的anosmin-1蛋白被證實不僅能通過FGFR1提高了成纖維細胞生長因子信號［21］，而且能通過 PROKR2在 prokineticin信號傳導過程中發(fā)揮作用。鑒于上述觀點，本研究假設(shè)KAL1和PROKR2這2個突變體蛋白可在不同層次進行同樣的細胞內(nèi)活動，并且這一過程可能有助于其漸進性功能障礙，最終導致病變［20］。

通常，一些主要的發(fā)育型疾病在純合體狀態(tài)下表現(xiàn)得更加嚴重。在本研究中，患者癥狀表現(xiàn)為青春期發(fā)育不良和嗅覺減退/嗅覺缺失。另一方面，患者父母都攜帶PROKR2基因相同位點的雜合突變，但是沒有任何臨床癥狀。這一結(jié)果與以前的研究數(shù)據(jù)［22］的一致性，同時也進一步證實了之前其他幾項研究［23-25］的結(jié)果，即雙基因突變是一種全新的模式。

本研究存在3點潛在的不足之處，首先，本研究只對KAL1、PROK2和PROKR2 3個基因進行了測序，不能排除其他基因的突變情況，比如FGFR1。其次，只對基因的編碼區(qū)進行了測序，在其他一些調(diào)控區(qū)，比如啟動子和內(nèi)含子區(qū)域，這些區(qū)域都有可能產(chǎn)生新的剪接位點。因此，需要進一步研究排除以上的可能性。再次，3個預(yù)測結(jié)果顯示I565T(KAL1)和Y113H(PROKR2)可能為致病的突變位點，但是只有2個預(yù)測結(jié)果顯示S570T(KAL1)為可能的致病位點，筆者考慮到S570T為目前為止首次發(fā)現(xiàn)的一個突變位點，且Polyphen和Mutation Taster這兩種預(yù)測方法準確性都比較高，因此筆者推測S570T也很可能是一個致病位點。然而功能缺失分析都只是建立在生物信息學預(yù)測的基礎(chǔ)上，尚需要進一步的基礎(chǔ)實驗確認驗證。

綜上所述，本研究擴展了KAL1與PROKR2基因在KS患者中突變的多樣性，進一步證實了這兩個基因在嗅球發(fā)育中的作用。此外，本研究進一步證實了KS患者雙基因遺傳的可能性，為KS遺傳傳遞的復雜性提供了新的數(shù)據(jù)。

［1］ Hu Y，Tanriverdi F，MacColl G S，et al.Kallmann's syndrome:molecular pathogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2003，35(8):1157-1162.

［2］ Fechner A，F(xiàn)ong S，McGovern P.A review of Kallmann syndrome:genetics，pathophysiology，and clinical management［J］.Obstet Gynecol Surv，2008，63(3):189-194.

［3］ Ribeiro R S，Vieira T C，Abucham J.Reversible Kallmann syndrome:report of the first case with a KAL1 mutation and literature review［J］.Eur J Endocrinol，2007，156(3):285-290.

［4］ Franco B，Guioli S，Pragliola A，et al.A gene deleted in Kallmann's syndrome shares homology with neural cell adhesion and axonal path-finding molecules［J］.Nature，1991，353(6344):529-536.

［5］ Dode C，Levilliers J，Dupont J M，et al.Loss-of-function mutations in FGFR1 cause autosomal dominant Kallmann syndrome［J］.Nat Genet，2003，33(4):463-465.

［6］ Falardeau J，Chung W C，Beenken A，et al.Decreased FGF8 signaling causes deficiency of gonadotropin-releasing hormone in humans and mice［J］.J Clin Invest，2008，118(8):2822-2831.

［7］ Pitteloud N，Zhang C，Pignatelli D，et al.Loss-of-function mutation in the prokineticin 2 gene causes Kallmann syndrome and normosmic idiopathic hypogonadotropic hypogonadism［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(44):17447-17452.

［8］ Dode C，Teixeira L，Levilliers J，et al.Kallmann syndrome:mutations in the genes encoding prokineticin-2 and prokineticin receptor-2［J］.PLoS Genet，2006，2(10):e175.

［9］ Kim H G，Ahn J W，Kurth I，et al.WDR11，a WD protein that interacts with transcription factor EMX1，is mutated in idiopathic hypogonadotropic hypogonadism and Kallmann syndrome［J］.Am J Hum Genet，2010，87(4):465-479.

［10］ Tsai P S，Gill J C.Mechanisms of disease:Insights into X-linked and autosomal-dominant Kallmann syndrome［J］.Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2006，2(3):160-171.

［11］ Ng P C，Henikoff S.SIFT:Predicting amino acid changes that affect protein function［J］.Nucleic Acids Res，2003，31(13):3812-3814.

［12］ Adzhubei I A，Schmidt S，Peshkin L，et al.A method and server for predicting damaging missense mutations［J］.Nat Methods，2010，7(4):248-249.

［13］Schwarz J M，Rodelsperger C，Schuelke M，et al.MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations［J］.Nat Methods，2010，7(8):575-576.

［14］Kim S H，Hu Y，Cadman S，et al.Diversity in fibroblast growth factor receptor 1 regulation:learning from the investigation of Kallmann syndrome［J］.J Neuroendocrinol，2008，20(2):141-163.

［15］ Tsuge T，Shimokawa T，Horikoshi S，et al.Polymorphism in promoter region of Fcalpha receptor gene in patients with IgA nephropathy［J］.Hum Genet，2001，108(2):128-133.

［16］ Yamada R，Tanaka T，Unoki M，et al.Association between a single-nucleotide polymorphism in the promoter of the human interleukin-3 gene and rheumatoid arthritis in Japanese patients，and maximum-likelihood estimation of combinatorial effect that two genetic loci have on susceptibility to the disease［J］.Am J Hum Genet，2001，68(3):674-685.

［17］Cole L W，Sidis Y，Zhang C，et al.Mutations in prokineticin 2 and prokineticin receptor 2 genes in human gonadotrophin-releasing hormone deficiency:molecular genetics and clinical spectrum［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(9):3551-3559.

［18］ Badano J L，Katsanis N.Beyond Mendel:an evolving view of human genetic disease transmission［J］.Nat Rev Genet，2002，3(10):779-789.

［19］ Carlton V E，Harris B Z，Puffenberger E G，et al.Complex inheritance of familial hypercholanemia with associated mutations in TJP2 and BAAT［J］.Nat Genet，2003，34(1):91-96.

［20］ Pitteloud N，Quinton R，Pearce S，et al.Digenic mutations account for variable phenotypes in idiopathic hypogonadotropic hypogonadism［J］.J Clin Invest，2007，117(2):457-463.

［21］Gonzalez-Martinez D，Kim S H，Hu Y，et al.Anosmin-1 modulates fibroblast growth factor receptor 1 signaling in human gonadotropin-releasing hormone olfactory neuroblasts through a heparan sulfate-dependent mechanism［J］.J Neurosci，2004，24(46):10384-10392.

［22］ Dode C，Hardelin J P.Kallmann syndrome:fibroblast growth factor signaling insufficiency?［J］.J Mol Med(Berl)，2004，82(11):725-734.

［23］Gao Y Q，Danciger M，Ozgul R K，et al.Association of the Asn306Ser variant of the SP4 transcription factor and an intronic variant in the beta-subunit of transducin with digenic disease［J］.Mol Vis，2007，13:287-292.

［24］Muntoni F，Bonne G，Goldfarb L G，et al.Disease severity in dominant Emery Dreifuss is increased by mutations in both emerin and desmin proteins［J］.Brain，2006，129(Pt 5):1260-1268.

［25］Tosch V，Rohde H M，Tronchere H，et al.A novel PtdIns3P and PtdIns(3，5)P2 phosphatase with an inactivating variant in centronuclear myopathy［J］.Hum Mol Genet，2006，15(21):3098-3106.