紫外光譜法研究久效磷與堿基的相互作用

王 麗，劉 飛，桑宏慶

（安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

久效磷，分子式為C7H14NO5P，學(xué)名O，O－二甲基－O－（1－甲基－2－甲基氨基甲酰基）乙烯基磷酸酯，相對分子量為223.16，為乙烯型磷酸酯類殺蟲劑，兼具內(nèi)吸與觸殺作用，殺蟲譜廣，速效性好，殘存期長，對魚類及水生動物有毒，對鳥類和蜜蜂高毒，屬于高毒農(nóng)藥［1］。核酸適體（Aptamer）是一種新型的仿生生物識別元素，是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從人工體外合成的隨機(jī)寡核苷酸庫中反復(fù)篩選得到的能與靶分子特異性結(jié)合的單鏈的DNA或RNA［2－3］。如果能成功篩選久效磷的核酸適體，將為久效磷的檢測開拓新的思路。核酸適體篩選的首要步驟是寡核苷酸庫的構(gòu)建，堿基是寡核苷酸的重要組成，從微觀入手研究堿基和久效磷的作用，將為核酸適體庫的構(gòu)建及適體的篩選奠定基礎(chǔ)。

紫外可見吸收光譜是研究小分子與堿基和DNA相互作用的一種最簡便、最常用的技術(shù)，小分子與堿基的相互作用會引起特征吸收峰的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象及增色和減色現(xiàn)象，因此通過吸收峰的變化可以判斷堿基和小分子的作用程度［4－5］。童裳倫等［6］通過紫外可見吸收光譜法研究發(fā)現(xiàn)百草枯分子通過嵌插方式結(jié)合到小牛胸腺DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)上。何盈盈等［7］研究發(fā)現(xiàn)蒽與DNA堿基胸腺嘧啶以面對面相平行的方式發(fā)生了P－P電子給體受體作用。胡興等［8］研究發(fā)現(xiàn)金屬離子對DNA－抗蚜威結(jié)合的影響程度主要取決于金屬離子與DNA堿基和磷酸基團(tuán)間結(jié)合的相對親和比。張玥等［9］利用紫外光譜法研究了利谷隆與DNA的相互作用，推斷利谷隆與DNA可能發(fā)生嵌插作用。王麗等［10］曾通過紫外吸收光譜法研究甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果與四種堿基的相互作用，推斷了有機(jī)磷農(nóng)藥與核酸適體作用的活性位點(diǎn)。本文利用紫外吸收光譜法研究了不同pH值以及Na+、K+和Mg2+濃度條件下，四種堿基對久效磷紫外吸收光譜的影響，旨在了解久效磷與四種堿基的作用程度，為久效磷適體篩選過程中適體庫恒定區(qū)域的設(shè)計(jì)和緩沖體系的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

UV－1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）;AL204電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）;PHS－3B pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

久效磷標(biāo)準(zhǔn)品（上海市農(nóng)藥研究所，純度為97.4%）;腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶為生物試劑，購自上海生工生物技術(shù)有限公司;Tris、HCl、NaCl、KCl、MgCl2均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先研究不同 pH 值（分別為 7.0、7.2、7.4、7.6、7.8）條件下，久效磷與四種堿基的作用程度;然后在最適 pH 值條件下，研究 Na+濃度（分別為100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L）、K+濃度（分別為 20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L）、Mg2+濃度（分別為 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L）對它們的相互作用的影響;最后在最適的pH值、離子強(qiáng)度下，研究久效磷與四種堿基的作用。

1.3 紫外吸收光譜的測定

在不同pH值及離子強(qiáng)度的50 mmol/L Tris緩沖溶液條件下，取兩個(gè)1cm石英比色皿，向一個(gè)比色皿中加入3mL濃度為0.05mmol/L的久效磷溶液，另一個(gè)比色皿加入等量緩沖溶液，分別用濃度為5mmol/L的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四種堿基溶液依次進(jìn)行滴加，混勻，放置5min，以試劑空白為參比，掃描其200～350nm的紫外吸收光譜，每次滴加體積為10μL，因此可忽略體積效應(yīng)［11－12］，重復(fù)進(jìn)行4次滴加掃描（即久效磷與堿基摩爾比分別為3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4）記錄其特征吸光峰并按下式計(jì)算吸光度的變化率。

其中:A3∶0為久效磷與堿基摩爾比為3∶0時(shí)的久效磷的吸光度，A3∶4為久效磷與堿基摩爾比為3∶4時(shí)的久效磷的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對久效磷與堿基作用的影響

在各pH條件下，隨著四種堿基濃度的增加，久效磷215nm左右的峰有明顯紅移和減色效應(yīng)，說明久效磷與堿基發(fā)生了不同程度的作用。減色效應(yīng)可能因?yàn)榫眯Я椎摩?空軌道與堿基的π軌道發(fā)生偶合，使能量降低，導(dǎo)致π－π*躍遷能量減少，偶合后的π*軌道因部分填充電子，使π－π*躍遷幾率減?。?3］。紅移程度及吸光度的變化率如表1所示，由表1可知，pH 7.6時(shí)隨著腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶濃度的增加，久效磷的特征吸收峰有1～2nm的紅移現(xiàn)象，吸光度變化率最大，說明此體系下久效磷與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用最強(qiáng)。而對于胸腺嘧啶，pH 7.8時(shí)對久效磷特征吸收峰的影響較大，pH 7.6時(shí)次之。綜合考慮將pH 7.6定為最適的pH緩沖體系。

表1 pH對久效磷與堿基作用的影響Table 1 Effect of pH on interaction between monocrotophos and bases

2.2 Na+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中Na+的濃度，考察Na+對久效磷與堿基作用的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可知，對于腺嘌呤和胞嘧啶，添加Na+時(shí)的吸光度變化率均小于未添加Na+時(shí)的吸光度變化率，說明Na+對久效磷與腺嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制效應(yīng)，但Na+對維持核酸適體的二級結(jié)構(gòu)有一定作用，因此添加一定的Na+是必須的。在Na+濃度200 mmol/L時(shí)，隨著腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶的添加，吸光度的變化率最大，此時(shí)它們與久效磷的作用最強(qiáng)，此時(shí)鳥嘌呤與久效磷的作用也較強(qiáng)，因此Na+濃度定為200 mmol/L。

表2 Na+對久效磷與堿基作用的影響Table 2 Effect of Na+on interaction between monocrotophos and bases

2.3 K+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中K+的濃度，考察K+對久效磷與堿基作用的影響，結(jié)果如表3所示。由表3可知，K+對久效磷與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制作用，但在40 mmol/L時(shí)，吸光度的變化率相對較大。20 mmol/L的K+可以促進(jìn)久效磷與胸腺嘧啶的作用，而在較大濃度時(shí)又抑制久效磷與堿基的作用。綜合考慮久效磷與四種堿基的作用情況，K+濃度定為40 mmol/L。

表3 K+對久效磷與堿基作用的影響Table 3 Effect of K+on interaction between monocrotophos and bases

2.4 Mg2+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中Mg2+的濃度，考察Mg2+對久效磷與堿基作用的影響，結(jié)果如表4所示。由表4可知，添加Mg2+時(shí)的吸光度變化率均小于未添加Mg2+時(shí)的吸光度變化率，說明Mg2+對久效磷與腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用都有較強(qiáng)的抑制作用，但在15 mmol/L時(shí)，吸光度的變化率相對較大，此時(shí)久效磷與堿基間的作用相對較強(qiáng)，綜合考慮將Mg2+濃度定為15 mmol/L。

表4 Mg2+對久效磷與堿基作用的影響Table 4 Effect of Mg2+on interaction between monocrotophos and bases

2.5 混合離子對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6及各離子的最適濃度下，考察混合緩沖溶液中久效磷與堿基作用的強(qiáng)弱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著四種堿基的不斷滴加，久效磷的特征吸收峰發(fā)生減色效應(yīng)，均出現(xiàn)不同程度的紅移現(xiàn)象。滴加腺嘌呤時(shí)，久效磷的特征吸收峰紅移2nm，吸光度的變化率為2.52%;滴加鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶時(shí)，久效磷的特征吸收峰紅移1nm，吸光度的變化率分別為1.51%、4.59%、3.23%。因此，四種堿基與久效磷的作用程度大小依次為胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤。因此在構(gòu)建核酸適體庫時(shí)，可以適當(dāng)增加胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，久效磷和四種堿基的相互作用程度有較大差異，同種堿基在不同緩沖體系的條件下與久效磷的作用程度也不同，可能是久效磷的分子結(jié)構(gòu)中含有P=O，通過P=O鍵作為H的受體與堿基中的－NH2，－NH提供的H結(jié)合形成NH—O鍵［14］，由于不同堿基結(jié)構(gòu)里的－NH2，－NH基團(tuán)數(shù)量不同致使久效磷與堿基的相互作用程度有較大差異。此外，金屬離子對久效磷與堿基結(jié)合的影響主要取決于金屬離子與堿基結(jié)合的類型及強(qiáng)弱，與堿基結(jié)合能力越強(qiáng)的金屬離子，在競爭反應(yīng)中能夠降低久效磷與堿基的結(jié)合［15］，表現(xiàn)出抑制作用。金屬離子與堿基結(jié)合的穩(wěn)定性主要取決于離子電荷和半徑，所帶電荷越高與堿基結(jié)合穩(wěn)定性越強(qiáng)，Mg2+的結(jié)合穩(wěn)定性強(qiáng)于Na+、K+，故Mg2+對久效磷與堿基的抑制作用最明顯。又由于K+離子半徑大于Na+離子半徑，K+的結(jié)合穩(wěn)定性大于Na+，因此，K+對久效磷和堿基的抑制效果更強(qiáng)。

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