EphA4在人上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義*

王玉樓，張靜艷，溫秋婷△

(1．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外一科，黑龍江齊齊哈爾161042;2．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江齊齊哈爾161006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，且發(fā)病年齡有年輕化的傾向［1］。卵巢癌的發(fā)病和進(jìn)展隱匿，往往在確診時(shí)已為晚期，因此尋找更好的與預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。生促紅素肝細(xì)胞受體激酶(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line，Eph)是酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinases，PTKs)家族中的最大的分支，有研究顯示Eph家族蛋白與腫瘤的發(fā)生和腫瘤血管的形成有關(guān)［2-3］。本研究采用免疫組化法檢測E-phA4蛋白，用原位雜交檢測EphA4mRNA在卵巢腫瘤中的表達(dá)，并分析其與卵巢癌的生物學(xué)行為之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 材料

收集我院病理科2006年1月至2011年12月存檔的原發(fā)性卵巢癌根治術(shù)手術(shù)標(biāo)本84例，常規(guī)石蠟包埋?；颊吣挲g32～76歲，平均年齡51．4歲±6．9歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無轉(zhuǎn)移者32例。臨床分期:Ⅰ期10例、Ⅱ期6例、Ⅲ期51例、Ⅳ期17例。病理學(xué)分級:高分化17例，中分化26例，低分化41例。病理類型:漿液性腺癌51例、粘液性腺癌28例、內(nèi)膜樣腺癌5例。以20例卵巢良性腫瘤(卵巢漿液性囊腺瘤及粘液性囊腺瘤)作為對照組。

1．2 EphA4蛋白的檢測

免疫組織化學(xué)SP法，EphA4兔抗人多克隆抗體購自天津賽爾生物公司，工作液濃度為1:100，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉公司，PBS代替一抗作為陰性對照，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1．3 EphA4mRNA 的檢測

非放射性地高辛標(biāo)記cDNA為探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤8h，以消除RNA酶。雜交過程:組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟，系列酒精復(fù)水，3%H2O2室溫10min，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫消化30min。每張切片滴加20μL預(yù)雜交液，將濕盒置于37℃恒溫箱中孵育4h。每片滴加20μL雜交液，38℃～42℃恒溫箱過夜。雜交后用預(yù)熱的SSC洗滌，37℃封閉30min。滴加生物素化鼠抗地高辛于37℃作用60min，加入SABC 37℃作用20min，滴加生物素化過氧化物酶37℃作用20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1．4 結(jié)果判定

原位雜交及免疫組化染色均用DAB顯色，二者均以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。每例各觀察兩張切片，避開腫瘤邊緣和壞死區(qū)各隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，結(jié)果以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來判定:細(xì)胞未見棕黃色顆?；蜿栃约?xì)胞數(shù)＜10%為陰性“-”，著色淺或陽性細(xì)胞數(shù)占11%～25%記“+”，著色深黃或陽性細(xì)胞數(shù)占26%～50%記“++”，著色為棕色或陽性細(xì)胞數(shù)＞50%記“+++”［4］。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件，EphA4蛋白和 E-phA4mRNA在卵巢腫瘤中陽性表達(dá)率的比較，E-phA4蛋白和EphA4mRNA的表達(dá)與卵巢癌的臨床病理特征的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 EphA4蛋白在卵巢腫瘤組織中的表達(dá)情況

免疫組化檢測結(jié)果，EphA4的表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜(圖1)，在卵巢癌中的陽性表達(dá)率為78．57%(66/84);而20例良性卵巢病變中，陽性率為25．0%(5/20)，且均為弱表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21．401，P ＜0．01)(表1)。

圖1 EphA4蛋白在卵巢良性腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)(×400)Figure 1 EphA4 protein expression in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

表1 EphA4在卵巢癌和卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)Table 1 EphA4 protein expression in epithelial ovarian cancer and benign ovarian tumor

卵巢癌中EphA4的陽性表達(dá)率78．57%(66/84)明顯高于卵巢良性腫瘤中的表達(dá)率25．0%(5/20)(χ2=21．401，P ＜0．01)。

2．2 EphA4蛋白陽性表達(dá)和臨床病理資料的關(guān)系

EphA4蛋白的表達(dá)在卵巢癌組織學(xué)分級，臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在分組比較中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達(dá)率86．76%明顯高于早中期卵巢癌(Ⅰ+Ⅱ期)的陽性表達(dá)率 43．75%(P ＜0．01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組88．46%明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組62．50%(P＜0．01);隨著卵巢癌病理分級的升高，EphA4蛋白的表達(dá)逐漸增加，中低分化卵巢癌的陽性表達(dá)率85．07%高于高分化卵巢癌的陽性表達(dá)率52．94%(P ＜0．05)。見表2。

表2 EphA4蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 The relationship between EphA4 protein expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

2．3 EphA4mRNA在卵巢腫瘤組織中的表達(dá)情況

EphA4mRNA的陽性信號主要位于胞漿。良性卵巢腫瘤、高分化卵巢癌、低分化卵巢癌的陽性率分別為 19．43%、47．06%、86．57%，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。EphA4mRNA的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系，在卵巢癌的組織學(xué)分級，臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組比較中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而與患者的年齡，組織學(xué)分型及有無腹水無明顯相關(guān)性(P ＞0．05)。

表3 EphA4mRNA的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系Table 3 The relationship between EphA4mRNA expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

圖2 EphA4mRNA在卵巢良性腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)(×400)Figure 2 EphA4 mRNA expression in in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

3 討論

細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中機(jī)制的研究，是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。信號傳導(dǎo)通路中各蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要調(diào)控方式之一，負(fù)責(zé)這一修飾調(diào)節(jié)的是蛋白激酶與蛋白磷酸酶。生促紅素肝細(xì)胞受體激酶(Eph)及其配體ephrin是酪氨酸激酶受體家族(RTKs)中最大的亞家族，根據(jù)Eph亞族各成員的同源性，表達(dá)分布以及結(jié)合配體的不同，可將其分為EphA和EphB亞型，相應(yīng)的配體也有兩個(gè)亞型ephrinA和ephrinB，EphA4受體既可與ephrinA類配體結(jié)合，還可與ephrinB2和ephrinB3結(jié)合［5］。

EphA4/ephrin作用體系，通常以較低的水平表達(dá)于成人各種上皮細(xì)胞中，能夠潛在激活雙向信號傳導(dǎo)通路和細(xì)胞效應(yīng)，分別充當(dāng)“受體”和“配體”兩個(gè)角色，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、遷移、變形和粘附等，還參與調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向、突觸形成等神經(jīng)發(fā)育過程。近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤演進(jìn)過程中也有重要作用，可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、粘附、變形及血管生成等過程，影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，而且還可能與腫瘤的血管生成有關(guān)［6］。

研究發(fā)現(xiàn)EphA/ephrin在許多腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常組織，提示EphA/ephrin可能與腫瘤的許多惡性生物學(xué)行為相關(guān)，如腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并可能參與促進(jìn)腫瘤血管形成［7］。以往的研究發(fā)現(xiàn)在人類前列腺癌和胰腺癌組織中，有EphA4受體的高表達(dá)［8］;EphA4受體的高表達(dá)與胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)［9-12］。本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測EphA4基因和EphA4蛋白在卵巢腫瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示EphA4mRNA及E-phA4蛋白在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于卵巢良性腫瘤(P＜0．01)。EphA4蛋白和EphA4mRNA的表達(dá)在卵巢癌的組織學(xué)分級，臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組比較中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而與患者的年齡、組織學(xué)分型及有無腹水等無明顯相關(guān)性(P＞0．05)。EphA4蛋白在晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達(dá)率86．76%明顯高于早中期卵巢癌(Ⅰ +Ⅱ期)的陽性表達(dá)率 43．75%(P ＜0．01)，并且隨著卵巢癌分化程度的降低，EphA4的表達(dá)逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。一些研究表明，將EphA4基因轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞系后，高表達(dá)的EphA4受體使癌細(xì)胞的生長速度變快［8］，如將EphA4的siRNA轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞后，可以大大降低胰腺癌細(xì)胞的生存能力，提示Eph基因可能成為腫瘤生物治療的靶點(diǎn)［13］。并且EphA4/ephrin還可能通過血管生成因子和血管生成素促使腫瘤血管的大量產(chǎn)生［14］，為腫瘤的生長提供所需營養(yǎng)，同時(shí)也為腫瘤的轉(zhuǎn)移開辟了潛在的途徑。

綜上所述，EphA4在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其作用機(jī)制尚不完全明確。進(jìn)一步研究EphA4在卵巢癌中的作用機(jī)制有助于探索卵巢癌治療更有效的分子靶點(diǎn)。同時(shí)進(jìn)一步明確E-phA4基因?qū)β殉舶┗颊哳A(yù)后的影響，有助于對預(yù)后較差的卵巢癌患者亞群進(jìn)行更加積極的干預(yù)措施。

［1］ 陳秀英，李 斌．納米技術(shù)在卵巢癌診治中的應(yīng)用進(jìn)展［J］．中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，29(1):78-80．

［2］ De Mejia EG，Dia VP．The role of nutraceutical proteins and peptides in apoptosis，angiogenesis，and metastasis of cancer cells［J］．Cancer Metastasis Rev，2010，29(3):511-528．

［3］ 鄭慶峰，柳碩巖，王海燕，等．EphB4及其配體EphrinB2在食管鱗癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系［J］．中國腫瘤臨床，2013，40(10):579-582．

［4］ 于 泳，竇科峰，王家林，等．EphA3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］．世界華人消化雜志，2013，21(9):835-839．

［5］ 羅 超，田 剛，許民輝．Eph受體和Ephrin配體的研究進(jìn)展［J］．中國癌癥雜志，2003，13(1):79-82．

［6］ Giorgio C，Hassan Mohamed I，F(xiàn)lammini L，et al．Lithocholic acid is an Eph-ephrin ligand interfering with Eph-kinase activation［J］．PloS One，2011，6(3):e18128．

［7］ Mosch B，Reissenweber B，Neuber C，et al．Eph receptors and ephrin ligands:important players in angiogenesis and tumor angiogenesis［J］．J Oncol，2010，2010:Article ID 135285．

［8］ Liizumi M，Hosokawa M，Takehara A，et al．EphA4 receptor，overexpressed in pancreatic ductal adenocarcinoma，promotes cancer cell growth［J］．Cancer Sci，2006，97(11):1211-1216．

［9］ Duxbury MS，Ito H，Zinner MJ，et al．EphA2:a determinant of malignant cellular behavior and a protential therapeutic target in pancreatic adenocarcinoma［J］．Oncogene，2004，23(7):1448-1456．

［10］ Oki M，Yamamoto H，Taniguchi H，et al．Overexpression of the receptor tyrosine kinase Epha4 in human gastric cancer［J］．World J Gastroenterol，2008，14(37):5650-5656．

［11］王慶元，張謝夫，趙春臨，等．EphA4在胃癌組織中的表達(dá)及意義［J］．山東醫(yī)藥，2010，50(7):26-28．

［12］蘇 玲，張 標(biāo)，曹曉蕾．EphA4基因在胃癌中的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)的關(guān)系［J］．交通醫(yī)學(xué)，2009，23(5):468-470．

［13］ Nakada M，Niska JA，Miyamori H，et al．The phosphorylation of EphB2 receptor regulates migration and invasion of human glioma cells［J］．Cancer Res，2004，64(9):3179-3185．

［14］ Herath NI，Boyd AW．The role of Eph receptors and ephrin ligands in colorectal cancer［J］．Int J Cancer，2010，126(9):2003-2011．