雷公藤甲素對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟乙酰肝素酶表達(dá)及蛋白尿的影響

曹英杰，陳曉嵐范亞平，楊紅利

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 南通 226001）

HSPG是腎小球基底膜的重要組成成分，構(gòu)成腎小球?yàn)V過的電荷屏障，其結(jié)構(gòu)的破壞系導(dǎo)致蛋白尿的重要原因。Hpa是一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，能識(shí)別HSPG的側(cè)鏈［1－2］。將側(cè)鏈水解為多個(gè)小分子片段，導(dǎo)致腎小球基底膜電荷屏障的破壞。近年來研究表明其表達(dá)異常與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［3－4］。雷公藤的主要有效成分雷公藤甲素（triptolide），具有多種藥理作用，包括免疫抑制、抑制炎性反應(yīng)、抗腫瘤、抗生育等。在各種腎小球疾病中，其可以通過多種有效機(jī)制保護(hù)及修復(fù)腎小球足細(xì)胞［5－6］。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察阿霉素腎病大鼠模型腎小球中Hpa和HSPG的表達(dá)，及雷公藤甲素治療后表達(dá)的改變，探討Hpa在此模型中的病理作用及其可能的致病機(jī)制，及雷公藤甲素對(duì)其的保護(hù)作用，為臨床治療腎臟病提供理論基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，每只體重200～230g，取自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兔抗鼠Hpa抗體購于Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司，羊抗鼠HSPG抗體購于lifespan公司，生物素化羊抗兔和兔抗羊二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。注射用阿霉素購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號(hào)091002），雷公藤甲素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠1周后按隨機(jī)分組法分為3組，①A組（對(duì)照組）；②B組（阿霉素模型組）：大鼠尾靜脈一次性注射阿霉素5mg／kg；③C組（雷公藤甲素治療組）：大鼠尾靜脈一次性注射阿霉素5mg／kg后，次日起給予雷公藤甲素（0.2mg／kg／d）灌胃，連續(xù)治療4周。其中A組及B組均在次日給予同療程等量生理鹽水灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠24h尿蛋白定量 兩組大鼠分別在注射阿霉素前（0d）及注射后第7、14、21、28d單獨(dú)置代謝籠，收集24h尿液，24h尿蛋白定量測(cè)定應(yīng)用雙縮脲比濁法。

1.3.2 大鼠腎組織Hpa及HSPG的表達(dá) 4%多聚甲醛固定大鼠腎組織，制3μm石蠟切片，行HE、PAS染色。按試劑盒說明書操作免疫組化，脫蠟水化3μm石蠟切片，熱誘導(dǎo)修復(fù)，3%過氧化氫20min后，20%羊血清室溫孵育30min，分別滴加一抗兔抗鼠Hpa（1∶100）和羊抗鼠HSPG（1∶50）4℃過夜。滴加二抗50μl，濕盒37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素襯染色，樹脂封片。每只大鼠腎組織切片選取隨機(jī)5個(gè)腎小球高倍視野，陽性為呈棕黃色顆粒狀物質(zhì)沉積，全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（Leica公司，Quantiment 570970）掃描分析，計(jì)算陽性吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各個(gè)組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組及對(duì)照組腎臟病理改變

注射阿霉素2周后光鏡下腎小球改變不明顯，電鏡下見上皮細(xì)胞足突廣泛融合，提示造模成功，符合腎小球微小病變病理特征（圖1B組）。A組為對(duì)照組。

圖1 阿霉素腎病大鼠及對(duì)照組大鼠腎臟病理改變

2.2 各組大鼠24h尿蛋白定量的變化

見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白定量的變化 mg／24h

A組各時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白定量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組第7天24h尿蛋白定量有所增加，但與A、C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第14、21及28天時(shí)，B組24h尿蛋白定量較同時(shí)間點(diǎn)A組及同組前一時(shí)間點(diǎn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。C組中第14、21及28天時(shí)尿蛋白定量較同時(shí)間點(diǎn)A組及同組前一時(shí)間點(diǎn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與B組比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 腎組織中Hpa及HSPG的表達(dá)

A組各時(shí)間點(diǎn)Hpa的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。第14、21及28天時(shí)，B組、C組Hpa的表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)A組及同組前一時(shí)間點(diǎn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2，圖2，圖4）。而HSPG的表達(dá)則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組中第14、21及28天時(shí)Hpa的表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)B組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而HSPG的表達(dá)則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3，圖3，圖5）。

表2 各組Hpa免疫組化半定量結(jié)果（吸光度A值）

表3 各組HSPG免疫組化半定量結(jié)果（吸光度A值）

圖2 各組Hpa的表達(dá)（吸光度A值）

圖3 各組HSPG的表達(dá)（吸光度A值）

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)Hpa的表達(dá)（免疫組化，×400）

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)HSPG的表達(dá)（免疫組化，×400）

2.4 各組尿蛋白定量與Hpa的表達(dá)呈正相關(guān)

各組尿蛋白定量與Hpa的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.768，P＜0.05），Hpa與HSPG的表達(dá)成負(fù)相關(guān)（r＝－0.691，P＜0.05）

見圖6、圖7。

圖6 尿蛋白定量與Hpa的表達(dá)呈正相關(guān)

圖7 Hpa與HSPG的表達(dá)成負(fù)相關(guān)

3 討論

HSPG是一種位于細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的大分子物質(zhì)，主要由足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞分泌，作為足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞的附著點(diǎn)，其主要作用是為腎小球?yàn)V過膜的電荷屏障提供負(fù)電荷［7－8］。Hpa于N－乙酰葡萄糖苷和D－葡萄糖醛酸結(jié)合部位切斷HSPG的HS側(cè)鏈，使其逐段分解，導(dǎo)致多種與HS結(jié)合的活性因子釋放，如抗凝血酶Ⅲ、血小板源性生長因子、肝細(xì)胞生長因子等，參與多種生理與病理過程。

Triptolide主要用于各種自身免疫性疾病及腎炎的治療，是雷公藤的主要有效成分之一［9－10］，其具有保護(hù)足細(xì)胞、抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用［11］。目前有關(guān)雷公藤對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用研究較多，其可以通過多種機(jī)制對(duì)腎小球足細(xì)胞起保護(hù)作用。研究表明triptolide對(duì)被動(dòng)型Heymann腎炎療效顯著，其對(duì)足細(xì)胞足突融合有抑制作用，促進(jìn)nephrin和podocin等足細(xì)胞裂孔膜關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而促進(jìn)裂孔膜蛋白結(jié)構(gòu)的修復(fù)和減輕足細(xì)胞病變［12］，有效地減少蛋白尿。

阿霉素大鼠模型是經(jīng)典的微小腎病動(dòng)物模型，許多臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Hpa表達(dá)異常可能與微小病變腎病蛋白尿的發(fā)生有關(guān)。KramerA等研究發(fā)現(xiàn)活性氧族（ROS）及腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）調(diào)節(jié)阿霉素腎?。ˋN）大鼠腎小球Hpa的表達(dá)［13］。但鮮有對(duì)HSPG表達(dá)及雷公藤甲素對(duì)其的影響研究。本實(shí)驗(yàn)以5mg／kg阿霉素尾靜脈注射造模，動(dòng)態(tài)觀察了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)尿蛋白變化，并觀察腎臟病理變化以及腎臟組織Hpa與HSPG表達(dá)的改變。注射7d后尿蛋白開始增多，24h尿蛋白定量在14d后進(jìn)行性升高，并與Hpa表達(dá)呈正相關(guān)，與HSPG表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。組織學(xué)檢測(cè)光鏡下腎小球系膜增生不明顯，病變輕微。電鏡下顯示腎小球足細(xì)胞足突廣泛融合，符合腎小球微小病變改變。而在雷公藤甲素治療組中，24h尿蛋白定量及Hpa表達(dá)明顯降低，而HSPG的表達(dá)升高。提示雷公藤甲素可能通過抑制Hpa而減少HSPG的降解，保護(hù)腎小球基底膜的電荷屏障，從而改善蛋白尿。

綜上所述，Hpa表達(dá)增加及活性增強(qiáng)在腎小球疾病蛋白尿發(fā)生發(fā)展中具有重要病理作用。雷公藤可以通過抑制Hpa的表達(dá)而減少蛋白尿的發(fā)生，可能成為雷公藤治療腎臟病新的靶點(diǎn)。

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