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    益氣通絡(luò)方對(duì)慢性缺血性腎病早期大鼠AngⅡ、α-SMA表達(dá)的影響*

    2014-12-01 08:52:32劉蘭英李嬌艷李根茂葛東宇
    關(guān)鍵詞:模型

    李 偉,劉蘭英,李嬌艷,李根茂,葛東宇

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心,北京 100029)

    慢性缺血性腎病(chronic ischaemic renal disease,CIRD)是指因腎動(dòng)脈狹窄(renal artery stenosis,RAS)或阻塞≥60%,引起腎血流動(dòng)力學(xué)顯著改變,從而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率下降、腎功能不全的1種慢性腎臟疾病[1],是中老年人(年齡≥50歲)發(fā)生終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一[2]。臨床上,我們通過(guò)益氣通絡(luò)法治療慢性缺血性腎病早期病變?nèi)〉昧溯^好療效。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀(guān)察益氣通絡(luò)方對(duì)慢性缺血性腎病早期大鼠腎組織AngⅡ、α-SMA表達(dá)的影響,以探討其防治慢性缺血性腎病早期病變可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物

    SD雄性大鼠60只,190~210 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001)。

    1.2 藥物

    益氣通絡(luò)方組成:黃芪10 g,黨參10 g,當(dāng)歸10 g,桂枝 10 g,川芎 10 g,赤芍 10 g,全蝎 6 g,地龍 6 g,熟大黃6 g,白花蛇舌草10 g,炙甘草5 g,為康仁堂制藥廠(chǎng)生產(chǎn)的配方顆粒。

    1.3 試劑

    AngⅡ抗體:北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)bs-0587R);α-SMA抗體:武漢博士德生物工程有限公司(貨號(hào)BM0002);兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)PV-9001);小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)PV-9002)。

    1.4 儀器

    光學(xué)顯微鏡:奧林巴斯公司(型號(hào)L340099);顯微照相機(jī):OLYMPUS。

    1.5 方法

    1.5.1 SD雄性大鼠慢性缺血性腎病模型復(fù)制方法 將模型組和各藥物組的大鼠用10%的水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉,打開(kāi)腹腔,分離出雙側(cè)腎動(dòng)脈,把直徑為0.30 mm的針灸針與腎動(dòng)脈血管長(zhǎng)軸緊貼平行放置,用1號(hào)手術(shù)縫線(xiàn)將腎動(dòng)脈和針灸針一起扎緊,然后抽出針灸針,關(guān)閉手術(shù)切口。假手術(shù)組除不放置針灸針和不用手術(shù)縫線(xiàn)緊扎外,其余手術(shù)操作均同上。

    1.5.2 分組及給藥 將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組,每組各15只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(術(shù)后次日灌胃生理鹽水3 ml/只,每日1次)、模型組(術(shù)后次日灌胃生理鹽水3 ml/只,每日1次)、預(yù)防組(術(shù)前3 d灌胃益氣通絡(luò)方10.85 g/kg/d,每日1次)、藥物組(術(shù)后次日灌胃益氣通絡(luò)方10.85 g/kg/d,每日1 次)。

    1.5.3 取材及觀(guān)察指標(biāo) 術(shù)后14 d處死大鼠,迅速取其雙側(cè)腎臟,一部分放入4%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片行腎臟免疫組化。免疫組化圖像根據(jù)染色的深淺(光密度)及分布面積來(lái)確定目標(biāo)蛋白量。采用Image-Pro P1us 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,每張切片隨機(jī)取至少5個(gè)視野,比較各組平均光密度值。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較用LSD法,各種檢驗(yàn)的顯著性水平設(shè)定為P<0.01。

    圖1 各組大鼠腎組織AngⅡ免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

    2 結(jié)果

    表1、圖1、2顯示,與正常組比較,模型組的AngⅡ、α-SMA表達(dá)均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,藥物組及預(yù)防組AngⅡ、α-SMA表達(dá)均明顯降低(P<0.01);預(yù)防組與藥物組比較,AngⅡ、α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

    表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各組表達(dá)的光密度分析(±s)

    表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各組表達(dá)的光密度分析(±s)

    注:與正常組比較:△P<0.01;與模型組比較:*P<0.01

    組 別 例數(shù) AngⅡ α-SMA假手術(shù)組0.000 0.000 15 70.55±1.69 69.95±0.81模 型 組 15 132.61±1.57△ 105.66±0.91△藥 物 組 15 109.70±1.59* 90.93±0.97*預(yù) 防 組 15 89.83±1.47* 76.21±1.07*F 283.490 286.124 P

    圖2 各組大鼠腎組織AngⅡ免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

    3 討論

    腎動(dòng)脈狹窄時(shí),腎內(nèi) RAS系統(tǒng)被激活,局部RAS系統(tǒng)被激活,有可能與慢性缺血性腎病腎間質(zhì)纖維化有關(guān)。在RAS系統(tǒng)中,AngⅡ被認(rèn)為是發(fā)揮作用的最主要因子[5],它可以促進(jìn)血管收縮,導(dǎo)致腎臟血流量減少,并與局部浸潤(rùn)活化的巨噬細(xì)胞共同參與腎臟炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腎臟纖維化的進(jìn)展。大量研究顯示,慢性缺血性腎損害可以作為腎間質(zhì)纖維化的1個(gè)獨(dú)立影響因素,Myo-FB又在腎缺血導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化中起重要作用,它可以分泌膠原纖維連接蛋白,促使ECM的聚集,導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。α–SMA是Myo-FB的標(biāo)志性蛋白,在腎間質(zhì)纖維化的早期即可出現(xiàn),可作為慢性缺血性腎病腎間質(zhì)纖維化的早期評(píng)判指標(biāo)[6~8]。

    楊步軍[9]認(rèn)為,本病多因先天不足,后天失養(yǎng),以致脈道受損、經(jīng)絡(luò)阻塞、氣血運(yùn)行不暢、氣滯血瘀而成。吳以嶺絡(luò)病理論[10]認(rèn)為,腎動(dòng)脈不全結(jié)扎致腎動(dòng)脈狹窄慢性缺血性腎損傷的中醫(yī)病機(jī)為腎絡(luò)損傷導(dǎo)致腎絡(luò)絀急(血管痙攣),進(jìn)而腎絡(luò)郁滯、腎絡(luò)瘀阻甚至腎絡(luò)瘀塞,針對(duì)病變?cè)缙跔I(yíng)衛(wèi)不通、腎絡(luò)郁滯病機(jī),治療應(yīng)以益氣通絡(luò)為主,方以益氣通絡(luò)方,黃芪、黨參、當(dāng)歸益氣補(bǔ)血,活血通絡(luò),“血中氣藥”川芎行營(yíng)氣助血運(yùn),合桂枝有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之義,全蝎、地龍搜風(fēng)通絡(luò),熟大黃、白花蛇舌草解毒通絡(luò),赤芍活血通絡(luò),合甘草緩攣急,合桂枝、甘草亦有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之義。

    本課題意圖揭示益氣通絡(luò)方防治慢性缺血性腎病的機(jī)制,結(jié)果表明益氣通絡(luò)方可能是通過(guò)降低AngⅡ、α-SMA的表達(dá)干預(yù)慢性缺血性腎病的發(fā)生發(fā)展。

    [1]Jacobson HR.Ischemic renal disease an overlooked clinical entity? [J].Kidney Int,1988,34(5):729.

    [2]柳昔傲.缺血性腎病診治研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)學(xué),2006,27(2):166-167.

    [3]賀巍,陳威,劉彥仿,等.實(shí)驗(yàn)性慢性腎缺血中腎小管-間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的規(guī)律及意義[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,24(4):286-288.

    [4]陳威,楊守京,劉彥仿,等.實(shí)驗(yàn)性慢性腎缺血模型腎小管-間質(zhì)細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)和意義[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(1):30-34.

    [5]郭登洲,王月華,邊東,等.活血化瘀消癥通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠血管緊張素系統(tǒng)的影響[J].中醫(yī)雜志,2010,51(1):75-78.

    [6]陳威,楊守京,劉彥仿,等.實(shí)驗(yàn)性慢性腎缺血模型腎小管-間質(zhì)細(xì)胞 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)和意義[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(1):30-34.

    [7]林瓊真,于潔.肌成纖維細(xì)胞與腎間質(zhì)纖維化[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(5):304-307.

    [8]賀巍,陳威,劉彥仿,等.實(shí)驗(yàn)性慢性腎缺血中腎小管-間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的規(guī)律及意義[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,24(4):286-288.

    [9]楊步軍,郝占峰,張建軍,等.中西醫(yī)結(jié)合治療大動(dòng)脈炎腎性高血壓療效觀(guān)察[J].中醫(yī)雜志,2010,51(1):162-163.

    [10]吳以嶺.脈絡(luò)論[M].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,2010:11,184-186.

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