“寒熱并見(jiàn)”大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)＊

宋捷民，錢(qián)旭武，滕 曄，周 堯

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

臨床上寒熱錯(cuò)雜證，是病人個(gè)體在同一時(shí)間既有寒證表現(xiàn)又有熱證表現(xiàn)、寒證與熱證混雜而成的一類證候群。從轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，中醫(yī)動(dòng)物模型必須以臨床應(yīng)用主，強(qiáng)調(diào)從實(shí)驗(yàn)室到病床旁的連接。臨床上“寒熱錯(cuò)雜［1］”證頗多，中醫(yī)治擬“寒熱并用”［2］，如治療上熱下寒證之烏梅丸、治寒熱互結(jié)中焦證之半夏瀉心湯、治表寒里熱證之大青龍湯、治少陽(yáng)經(jīng)寒熱夾雜證之小柴胡湯等。但在中醫(yī)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究中，“寒熱證并見(jiàn)”動(dòng)物模型的建立尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組初次研究并建立中醫(yī)寒熱錯(cuò)雜證動(dòng)大鼠模型及評(píng)價(jià)指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(浙)2008-0033)。

1.2 試劑與藥品

丙硫氧嘧啶片，上海朝暉藥業(yè)有限公司(批號(hào)1304E16);知母(批號(hào) 130301)、石膏(批號(hào)130201)、番瀉葉(批號(hào)130305)，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司;安琪高活性干酵母由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);大鼠甲狀腺素(T4)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試 劑 盒 (貨 號(hào) RGB-20259R，LOT20131030、20259R)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，北京瑞格博科技發(fā)展公司;SOD酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(LOT 201306)、NO酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(LOT 201306)、MDA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(LOT 201306)，上海信帆生物科技有限公司。

1.3 儀器

HC-3018高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;MK3型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;ZJ202-OA型恒溫干燥箱(滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2400889號(hào))、肛溫計(jì)，浙江省諸暨市實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 方法

2.1 造模及給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，均無(wú)異常表現(xiàn)即納入實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記、稱重。結(jié)合陳小野等［3］和盧德趙等［4］的虛寒證造模方法，每天上午灌胃丙硫氧嘧啶100 mg·kg－1，灌胃30 min后放入4℃冰柜中冷凍6 h。下午灌胃100%知母石膏水煎液(知母石膏比例為3∶4)4 mL，第26天起加番瀉葉，空白組灌胃等量生理鹽水。大鼠灌胃共4周，期間各組正常飲水，第29天皮下注射20%干酵母混懸液［5］，使大鼠發(fā)熱，造“寒熱并見(jiàn)”動(dòng)物模型。于注射干酵母10 h后，收集模型組與正常組每只大鼠的大便少許，稱量。于注射干酵母13 h后眼眶取血1mL，檢測(cè) T3、T4、NO、MDA、SOD。

2.2 記錄及觀察

每天上午灌胃前測(cè)量大鼠體溫，并觀察大鼠一般狀態(tài)，記錄大鼠形態(tài)、毛發(fā)、爪甲顏色、生活習(xí)性、糞便狀態(tài)等，一直觀察到第4周(28 d)。第29天，大鼠皮下注射干酵母混懸液后，每小時(shí)測(cè)量1次體溫。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察

第1周2組大鼠一般狀態(tài)基本無(wú)差別，第2周模型組大鼠比正常組活動(dòng)減少，開(kāi)始出現(xiàn)毛發(fā)無(wú)澤、爪甲顏色變淺、體質(zhì)量下降、大便較軟現(xiàn)象。第3周模型組大鼠出現(xiàn)大便稀軟、弓背蜷縮、愛(ài)扎堆、懶動(dòng)嗜臥、行動(dòng)遲緩無(wú)力、形體消瘦、尾巴變涼、毛發(fā)枯槁無(wú)華。第4周模型組大鼠上述狀態(tài)較第3周更甚。尤其第26天起加灌番瀉葉后，排不成型含大量水和黏液的稀便。這些均符合中醫(yī)虛寒證動(dòng)物模型表現(xiàn)。

3.2 各組體質(zhì)量比較

表1顯示，正常組大鼠體質(zhì)量持續(xù)上升，模型組大鼠體質(zhì)量前3周上升，后1周相繼下降，且造模1周即與正常組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 給藥后28 d大鼠肛溫變化

表2顯示，模型組大鼠肛溫從第1周開(kāi)始出現(xiàn)下降，至第2周后與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且平均體溫一直比正常組低1℃以上，基礎(chǔ)體溫低下是寒證模型的主要指標(biāo)變化。

表1 大鼠體質(zhì)量比較(±s，g)

表1 大鼠體質(zhì)量比較(±s，g)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù)0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組 10 204.7±5.33 256.8± 9.22 284.4± 9.97 315.4±12.38 336.5±15.33模型組 10 205.2±4.08 241.1±11.12* 251.7±13.72＊＊ 256.7±12.14＊＊ 239.9± 8.37＊＊

表2 28 d 大鼠肛溫變化表(±s，℃)

表2 28 d 大鼠肛溫變化表(±s，℃)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù)0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組 10 38.00±0.16 38.05±0.17 37.79±0.20 37.47±0.24 37.68±0.22模型組 10 37.94±0.21 37.48±0.19＊＊ 37.25±0.13＊＊ 36.88±0.14＊＊ 36.52±0.16＊＊

3.4 注射干酵母混懸液后，造“寒熱并見(jiàn)”大鼠模型期間96 h肛溫變化

表3顯示，寒熱并見(jiàn)組造模開(kāi)始時(shí)平均基礎(chǔ)體溫低下，比正常組低1.5℃左右，在37℃上下，發(fā)熱造模后第8小時(shí)寒熱并見(jiàn)組體溫升至39℃，上升2℃，以后40個(gè) h之內(nèi)一直發(fā)熱，體溫在37.8℃至39℃內(nèi)波動(dòng)。第48小時(shí)后寒熱并見(jiàn)組體溫逐漸下降，第96小時(shí)體溫36.7℃，比正常組低1.1℃左右。

表3 模型組大鼠注射干酵母后2組大鼠肛溫比較

3.5 大便含水量變化

表4顯示，大鼠發(fā)熱后，收集模型組與正常組每只大鼠大便少許，稱量。再將每只大鼠的大便置于烘箱內(nèi)干燥至恒重，稱量、記錄、計(jì)算含水量。模型組排不成型含大量水和黏液的稀便，與正常組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大便含水量=(濕大便重量－干燥后重量)/濕大便重量。

表4 大便含水量比較(±s)

表4 大便含水量比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 含水量正常組10 0.85±0.04模型組 10 0.60±0.050＊＊

3.6 發(fā)熱后大鼠血清T3、T4含量的變化

表5顯示，注射干酵母13 h后，模型組與正常組眼眶取血1 ml檢測(cè)T3、T4。實(shí)驗(yàn)表明，大鼠發(fā)熱后，寒熱并見(jiàn)組大鼠T3、T4含量下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 血清T3、T4含量比較(±s)

表5 血清T3、T4含量比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.05

組 別 例數(shù) T3/(nmol·L－1)T4/(nmol·L－1)10 1697.73±113.54 30.39±2.21模型組 10 1156.28± 5.97＊＊ 22.15±0.77正常組＊＊

3.7 發(fā)熱后大鼠血清NO、MDA、SOD含量的變化

表6顯示，注射干酵母13 h后，模型組與正常組眼眶取血1 mL檢測(cè)NO、MDA、SOD。實(shí)驗(yàn)表明，大鼠發(fā)熱后，模型組大鼠NO、MDA、SOD含量下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)

表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01，＊＊P＜0.05

組 別 例數(shù) NO(μmo l·L －1)MDA(nmo l·L－1)SOD(U·m L－1)10 30.00±5.00 12.04±0.98 74.68±16.34模型組 10 22.00±5.17* 10.68±1.78＊＊ 57.09± 9.53正常組*

臨床上寒熱錯(cuò)雜證，是病人個(gè)體在同一時(shí)間既有寒證又有熱證表現(xiàn)、寒證與熱證混雜而成的一類證候群。但在同一動(dòng)物體上同時(shí)建立既有寒證又有熱證的中醫(yī)病證模型是很困難的。前期實(shí)驗(yàn)我們嘗試建立心陽(yáng)虛寒+胃熱、腎陽(yáng)虛寒+胃熱、肝火+胃寒等多種寒熱復(fù)合模型，最后結(jié)果或是單一寒證模型或是單一熱證模型，或是寒象熱象都不明顯，或是死亡率極高?？偨Y(jié)經(jīng)驗(yàn)后我們認(rèn)為，“寒熱錯(cuò)雜”動(dòng)物模型的建立，最大的阻礙是寒熱致病因素的對(duì)立性。在動(dòng)物模型的建立過(guò)程中，寒熱因素可產(chǎn)生相互抵消、相互中和、相互損傷的作用，而如何減少寒熱因素相互抵消是建立寒熱錯(cuò)雜證的關(guān)鍵。

若秋等［6］分析寒熱錯(cuò)雜證所現(xiàn)癥狀、體征共117個(gè)，主要是胃腸癥狀群與外部外征。認(rèn)為寒熱錯(cuò)雜證的出現(xiàn)可能是以機(jī)體功能狀態(tài)低下為前體，虛損癥是寒熱錯(cuò)雜證的重要表現(xiàn)之一。我們以臨床常見(jiàn)的脾胃虛寒又感風(fēng)熱，形成表熱里寒證之發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛、大便溏泄、四肢不溫為模板，采用丙硫氧嘧啶和寒涼中藥石膏、知母、番瀉葉長(zhǎng)時(shí)間灌胃的方法，加上冰柜中冷凍等多因素復(fù)合造模法制作虛寒證模型。在此基礎(chǔ)上，皮下注射干酵母混懸液致大鼠發(fā)熱，造成約40 h左右的“寒熱證并見(jiàn)”動(dòng)物模型。此動(dòng)物模型以虛寒為本、表熱為標(biāo)，表熱難以影響虛寒之本，寒熱因素相互抵消較少，較成功地研究復(fù)制出中醫(yī)寒熱錯(cuò)雜證大鼠模型?！昂疅岵⒁?jiàn)”動(dòng)物模型造模后，寒熱癥狀診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立與評(píng)價(jià)是很重要的。

4.1 體溫

體溫的高低是首要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠肛溫下降，7 d后與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。直至第28天，平均體溫一直比正常組低1℃以上，證明虛寒證模型已建立。注射干酵母混懸液后8 h模型組體溫升至39℃，以后40 h之內(nèi)體溫在37.8℃至39℃內(nèi)波動(dòng)，這表明模型組在虛寒證基礎(chǔ)上發(fā)熱并出現(xiàn)熱證。第48小時(shí)后出現(xiàn)寒熱并見(jiàn)模型組的體溫逐漸下降，第96小時(shí)體溫36.7℃，比正常組低1.1℃左右。這一點(diǎn)說(shuō)明40 h寒熱錯(cuò)雜模型結(jié)束后，模型組體溫又回歸原本虛寒證的狀態(tài)。

4.2 大便

同一動(dòng)物不可能同時(shí)有高低2個(gè)體溫，寒熱錯(cuò)雜模型組出現(xiàn)發(fā)熱和寒證指標(biāo)只能從體溫以外指標(biāo)中尋求。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)虛寒證多便溏的臨床特點(diǎn)，在大鼠發(fā)熱后收集每只大鼠的大便計(jì)算含水量。結(jié)果模型組排不成型含大量水和黏液的稀便，與正常組比較含水量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)證明，大鼠發(fā)熱同時(shí)呈現(xiàn)出虛寒證便溏的疾病癥狀，并可以量化檢測(cè)。

4.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

因?yàn)榇笫蟛豢赡芘c人直接交流，人與大鼠很多癥狀表現(xiàn)存在差異，單純從癥狀診斷評(píng)價(jià)動(dòng)物模型存在局限性。因此，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的建立是評(píng)價(jià)“寒熱錯(cuò)雜”動(dòng)物模型的重點(diǎn)。李敏等［7］研究發(fā)現(xiàn)，虛寒狀態(tài)下大鼠甲狀腺激素T3、T4水平降低。薛春苗等［8］將甲狀腺軸(T3和/或T4)作為虛寒模型Ⅰ級(jí)指標(biāo)，Ⅰ級(jí)指標(biāo)在虛寒模型中最重要，肯定會(huì)有變化，其中甲狀腺軸T3或T4或二者均顯著降低。黃仕文［9］等通過(guò)對(duì)寒凝胸痹大鼠研究發(fā)現(xiàn)，其模型組(未給藥)NO、SOD水平均明顯低于空白對(duì)照組。蘇?。?0］等對(duì)月經(jīng)病寒凝血瘀證患者研究發(fā)現(xiàn)，患者組血漿NO有降低趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠發(fā)熱后寒熱錯(cuò)雜組的大鼠T3、T4、NO、SOD含量下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明機(jī)體在發(fā)熱時(shí)可同時(shí)表現(xiàn)出虛寒狀態(tài)，而MDA含量降低，可能是因?yàn)閯?dòng)物機(jī)體在寒熱因素的共同刺激下，生物機(jī)能低下、代謝紊亂的結(jié)果，具體原因尚待研究。

總之，應(yīng)用多因素復(fù)合造模法制作虛寒證模型，在此基礎(chǔ)上皮下注射干酵母致大鼠發(fā)熱，造成約40 h左右的“寒熱并見(jiàn)”動(dòng)物模型是可行的。該造模方法簡(jiǎn)單易行、成功率高、數(shù)據(jù)量化，能模擬寒熱錯(cuò)雜證臨床表現(xiàn)及病理生理過(guò)程，為進(jìn)一步科學(xué)闡釋“寒熱并用”的配伍機(jī)制、探索寒熱藥性、研究“寒熱并用”方劑和治法提供了新的技術(shù)平臺(tái)。

［1］栗德林，樸勝華.寒熱錯(cuò)雜證探微［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003，31(6):15-17.

［2］周永學(xué).論方劑配伍中的寒熱并用［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2002(5):3-4.

［3］陳小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虛寒證模型的研制［J］.中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)報(bào)，2001，9(3):155-159.

［4］盧德趙，沃興德，李毅，等.溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥對(duì)丙基硫氧嘧啶引起腎陽(yáng)虛大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22.

［5］盧芳，董培良，陳平平，等.3種熱病證候模型最佳造模方法的探索與評(píng)價(jià)［J］.山東中醫(yī)雜志，2009，28(2):114-116.

［6］若秋，劉渡舟.寒熱錯(cuò)雜證之研究［J］.陜西中醫(yī)，1991，12(1)22-24.

［7］李敏，張冰，劉小青，等.虛寒狀態(tài)大鼠cAMP變化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(2):33-344.

［8］薛春苗，張冰，金銳，等.虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(8)2037-2041.

［9］黃仕文，戴啟剛.烏頭赤石脂丸對(duì)寒凝胸痹大鼠血液黏度、TXB2、6-keto-PGF1α、ET、NO、SOD 及 MDA 的影響［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，13(3):56-58.

［10］蘇健，杜慧蘭.月經(jīng)病寒凝血瘀證與ET、NO的關(guān)系及加減溫經(jīng)湯對(duì)其影響［J］.中成藥，2007，29(11):1571-1574.