三七、梔子組分配伍對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響＊

郭曉謹(jǐn)，李興廣△，李衛(wèi)紅△，胡京紅，周夢佳，蓋 聰，李芳赫，臧妍妍，萬亮琴，于慧芳

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;2.通州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 101100)

通絡(luò)救腦注射液(Tong luo jiu nao injection，TLJN)是針對(duì)缺血性腦卒中“毒損腦絡(luò)”病機(jī)［1］研發(fā)的現(xiàn)代注射劑，在缺血性腦損傷中發(fā)揮了良好的腦保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，該注射液能夠有效提高擬缺血損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性［2］，然而注射液中的2個(gè)有效組分梔子苷、三七總皂苷在血管保護(hù)中的內(nèi)在機(jī)制與組方特點(diǎn)，目前尚不明確。前期的研究顯示，2個(gè)組分在發(fā)揮療效的時(shí)間以及作用機(jī)制上有所不同［3］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從氧化損傷方面觀察TLJN、梔子苷、三七總皂苷各自的藥效特征，以期為該中藥復(fù)方組分配伍的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 方法

1.1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

采用實(shí)驗(yàn)室已建立的方法［4］，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞原代取材、分離純化和培養(yǎng)。

1.2 擬缺血損傷模型的制備

采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的氧糖剝奪模型［5］，細(xì)胞傳至第三代，用無糖的Kreb’s液置換原培養(yǎng)基，放入低氧培養(yǎng)箱(氣體含量為94%N2、5%CO2、1%O2)，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 6 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分成5組，分別為正常組、模型組、梔子苷組、三七總皂苷組、通絡(luò)救腦注射液組。除正常組外，其余各組按上述方法造模。各給藥組分別按梔子苷22 μg/ml、三七總皂苷22 μg/ml、通絡(luò)救腦注射液44 μg/ml的藥物濃度在造模前3 h及造模過程中給藥，處理結(jié)束后進(jìn)行下列指標(biāo)檢測。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

造模完成后每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定各組的吸光光度值，檢測波長為450 nm，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.5 生化法檢測MDA和SOD含量

各組細(xì)胞在干預(yù)因素作用后，用 D-Hank＇s液洗2次后，用細(xì)胞刮收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞，在冰上用細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞，4℃、117.6N離心20 min后取上清，BCA法檢測蛋白定量。MDA含量檢測，上樣量為100 μl，操作步驟按測定試劑盒說明進(jìn)行，在532 nm處，用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度值(OD值)。SOD活性檢測方法，上樣量為20 μl，操作步驟按測定試劑盒說明進(jìn)行，在450 nm處用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度值(OD值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

表1顯示，與正常組比較，模型組OD值顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，3個(gè)給藥組的OD值均有不同程度升高，通絡(luò)救腦注射液的作用均優(yōu)于2個(gè)組分(P ＜0.05)。

表1 各組藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(n=6，±s)

表1 各組藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(n=6，±s)

注:與正常對(duì)照組比較:＊＊ P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與梔子苷比較:△P ＜0.05，與三七總皂苷比較:□□P ＜0.01

組別 內(nèi)皮細(xì)胞活性(OD值)正常組2.638 ±0.138模型組2.012 ±0.147＊＊梔 子 苷 組 2.302 ±0.202#三 七 總 皂 苷 組 2.210 ±0.140#通 絡(luò) 救 腦 注 射 液 組 2.540 ±0.174##△□□

2.2 各組藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

表2顯示，與正常組比較，模型組MDA含量明顯升高(P ＜0.01)，SOD 活性降低(P ＜0.05)，說明氧糖剝奪模擬缺血損傷激活了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng);與模型組比較，3個(gè)給藥組的MDA含量均有不同程度下降，其中梔子苷對(duì)MDA的降低作用優(yōu)于三七總皂苷(P＜0.05)，通絡(luò)救腦注射液優(yōu)于兩組分(P＜0.01);與模型組比較，3個(gè)給藥組的SOD活性均有不同程度升高，三七總皂苷效果優(yōu)于梔子苷(P＜0.05)，通絡(luò)救腦注射液的作用均優(yōu)于2個(gè)組分(P ＜0.01)。

表2 各組藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響(n=3，±s)

表2 各組藥物對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響(n=3，±s)

注:與正常對(duì)照組比較:＊＊ P ＜0.01;與模型組比較:#P ＜0.05，##P ＜0.01;與梔子苷比較:△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與三七總皂苷比較:□P ＜0.05，□□P ＜0.01

組別 MDA含量(nmol/ml)SOD活性(U/mgprot)正 常 組23.847 ±2.396 40.140 ±0.231模 型 組 51.977 ±3.780＊＊ 20.120 ±0.531＊＊梔 子 苷 組 28.880 ±3.276#□ 25.448 ±0.524#三 七 總 皂 苷 組 38.016 ±2.632## 36.483 ±0.477##△通絡(luò)救腦注射液組 27.550±6.127#△□□ 37.426±0.708##△△□□

3 討論

通絡(luò)救腦注射液由梔子、三七配伍而成。梔子性寒味苦，具有涼血解毒之功;三七味甘性溫，具有和營止血、通脈行瘀之效，兩藥配伍共奏解毒、化瘀、通絡(luò)之效。前期的藥效學(xué)研究顯示，通絡(luò)救腦注射液對(duì)大鼠腦梗死具有良好的治療效果，明顯增加局部腦血流量，改善腦梗死所致大鼠的偏癱體征，減輕腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性損害，改善缺血區(qū)微循環(huán)，改善神經(jīng)功能缺損［6］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從氧化損傷方面觀察了TLJN、梔子苷、三七總皂苷各自的藥效學(xué)特征。從CCK-8檢測結(jié)果可以看出，通絡(luò)救腦注射液、梔子苷、三七總皂苷均能提高受損內(nèi)皮細(xì)胞的活性，對(duì)擬缺血內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，其中通絡(luò)救腦注射液的作用顯著優(yōu)于2個(gè)組分(P＜0.05)，體現(xiàn)了由兩有效組分配伍而成復(fù)方的療效優(yōu)勢。

腦缺血后，腦組織內(nèi)生成大量氧自由基(Oxygen free radical，OFR)，OFR的主要作用是引起細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)。由于腦組織中富含脂質(zhì)，因此腦對(duì)OFR損害尤為敏感，從而導(dǎo)致腦細(xì)胞膜損害，細(xì)胞代謝障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。MDA是氧自由基與生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，產(chǎn)生量與氧自由基的量相平行，因而測定MDA最可反映氧自由基的水平，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。SOD是體內(nèi)非常重要的氧自由基清除酶，可通過歧化方式清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，測定SOD可反映機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪后MDA含量顯著增加，SOD活性下降，表明在腦缺血時(shí)，細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)。梔子苷可有效降低受損細(xì)胞MDA含量，該作用比三七總皂苷顯著，而三七總皂苷在提高SOD活性方面優(yōu)于梔子苷，提示兩組分都具有抗氧化損傷作用，但發(fā)揮療效的環(huán)節(jié)有所不同，梔子苷在抑制自由基的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)方面作用突出，這可能與梔子“涼血解毒”的功效有關(guān);而三七總皂苷的抗氧化作用主要通過增強(qiáng)自身氧自由基清除的途徑實(shí)現(xiàn)的，這可能是中藥三七“補(bǔ)虛、通絡(luò)”功效的生物學(xué)基礎(chǔ)。通絡(luò)救腦注射液在降低MDA含量，提高SOD活性方面均具有顯著的作用，表明其抗氧化作用可能與上兩條途徑均有關(guān)，體現(xiàn)了復(fù)方對(duì)兩有效組分抗氧化作用的整合效應(yīng)。

綜上所述，通絡(luò)救腦注射液及其有效組分梔子苷、三七總皂苷均可通過抗氧化作用有效減輕內(nèi)皮細(xì)胞擬缺血損傷，提高細(xì)胞活性。梔子苷的抗氧化作用可能與抑制自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)，三七總皂苷可能與增強(qiáng)自由基的清除有關(guān)。通絡(luò)救腦注射液整體上明顯優(yōu)于2個(gè)組分，顯示了中藥組方配伍發(fā)揮整合調(diào)節(jié)的治療優(yōu)勢。

［1］李澎濤，王永炎，黃啟福.“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說的形成及其理論與實(shí)踐意義［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24(1):1-6.

［2］青雪梅，李衛(wèi)紅，侯金才，等.通絡(luò)救腦注射液對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性影響的特征［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6(2):15-18.

［3］李衛(wèi)紅，王東坡，李興廣，等.通絡(luò)救腦注射液及其組分對(duì)擬缺血損傷人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(6):42-46.

［4］李衛(wèi)紅，李澎濤，華茜，等.不同內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)皮層神經(jīng)元線粒體功能的影響及通絡(luò)救腦注射液的保護(hù)作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(2):131-134.

［5］朱元，李澎濤，李衛(wèi)紅，等.不同狀態(tài)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障特征性酶的影響［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(2):1393-1398.

［6］司銀楚，吳海霞，許紅，等.通絡(luò)救腦注射液對(duì)腦缺血大鼠腦皮質(zhì)梗塞灶Glu及其NMDA受體表達(dá)的影響［J］.中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003，18(8):466-513.

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