次黃嘌呤灌胃加冰敷法誘導大鼠急性痛風性關節(jié)炎模型

孫賽君，袁卉，蔣金鵬，陶露，錢鋒

（長江大學醫(yī)學院，湖北荊州434023）

痛風性關節(jié)炎是因嘌呤代謝紊亂導致高尿酸血癥、尿酸鹽在關節(jié)周圍沉積而引起的炎癥反應，臨床表現(xiàn)主要為紅腫熱痛［1－2］。目前國內外針對痛風性關節(jié)炎治療藥物的研究以降低血尿酸水平、消炎、消腫和鎮(zhèn)痛為主［3－5］。而研究所用動物模型仍以Coderre在1987年建立的關節(jié)腔注射微晶尿酸鈉（MSU）大鼠痛風性關節(jié)炎模型為主［6］。但是該模型并未涉及痛風性關節(jié)炎的發(fā)病基礎——高尿酸血癥，在評價抗痛風藥物的作用機制上有明顯缺陷。相對而言，高尿酸血癥的動物模型比較容易建立。目前有高嘌呤膳食、尿酸酶抑制劑和破壞尿酸酶表達基因等方法［7－9］。然而因多數(shù)哺乳動物體內都存在人體內沒有的尿酸酶，所以將高尿酸血癥模型轉化為痛風模型極為困難［10］。國內出現(xiàn)了聯(lián)合使用Coderre法和尿酸酶抑制劑或次黃嘌呤建立高尿酸痛風大鼠模型的嘗試［10］，但該方法只是分別誘發(fā)急性痛風性關節(jié)炎和高尿酸血癥，因此未被廣泛采用?，F(xiàn)存急性痛風性關節(jié)炎模型都有很多不完善之處，給痛風性關節(jié)炎的研究帶來了極大的不便，因此建立高尿酸血癥誘發(fā)的痛風性關節(jié)炎動物模型迫在眉睫。

從人類痛風性關節(jié)炎的發(fā)病情況來看，高尿酸血癥是其發(fā)病基礎，而寒冷的外部環(huán)境是其重要誘發(fā)因素之一。本實驗將以次黃嘌呤灌胃這種簡單的方法誘導大鼠短時間內出現(xiàn)高嘌呤血癥，同時對大鼠右下肢膝關節(jié)部位進行冰敷，觀察是否可誘發(fā)急性痛風性關節(jié)炎。如果誘發(fā)成功，則為該疾病的基礎和臨床研究建立了更為適用的動物模型。另外，因次黃嘌呤灌胃和冰敷對大鼠創(chuàng)傷較小，可重復多次進行，所以本實驗還將嘗試通過重復誘導同一關節(jié)的痛風來觀察是否可以建立慢性痛風性關節(jié)炎模型。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質量（200±20）g，由武漢大學動物實驗中心提供，實驗動物飼養(yǎng)許可證號：SCXK（鄂）2008－0004。次黃嘌呤（Sig ma產品）。

1.2 方法

1.2.1 次黃嘌呤溶液配置 次黃嘌呤5g溶于100 ml蒸餾水中，配成5%溶液，灌胃劑量按10 ml／kg體質量來計算。

1.2.2 動物分組 健康雄性SD大鼠25只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分4組進行實驗：正常組7只；冰敷組6只；次黃嘌呤灌胃組6只；次黃嘌呤灌胃加冰敷組6只。

1.2.3 冰敷方法 小氣球灌水冷凍1～2h，形成冰水混合物。將需要冰敷的SD大鼠以仰臥位包裹固定于木板上，保持右下肢伸直微曲。將含冰水混合物的小氣球用紗布包裹放置于右下肢膝關節(jié)正上方，接觸面覆蓋膝關節(jié)正面和左右兩側。每半小時更換一次，保持低溫。每天持續(xù)冰敷3h。次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在灌胃完成半小時后開始冰敷，其它同冰敷組。

1.2.4 結果判定 ①關節(jié)腫脹程度：冰敷完成1h后，關節(jié)屈位，測量橫向最大徑。每只大鼠取右下肢最大徑減左下肢最大徑差值，組內求平均值，然后進行組間統(tǒng)計學分析。②步態(tài)評分標準：冰敷完成2h后，觀察大鼠步態(tài)，正常行走記0分；輕微跛行，即右下肢略有彎曲，記1分；跛行，即右下肢可觸及地面但明顯彎曲，記2分；重度跛行，即右下肢不觸及地面，僅三足行走，記3分。組內求平均值，然后進行組間統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠右側膝關節(jié)腫脹程度比較

實驗過程持續(xù)10d，次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠從第3天開始出現(xiàn)顯著的關節(jié)腫脹及其它身體不適反應，第7天開始出現(xiàn)食欲不振和腹瀉，實驗第10天出現(xiàn)死亡，6只大鼠中死亡2只，于是決定停止實驗。與正常組大鼠比較，冰敷組和次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右側膝關節(jié)腫脹都有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），尤以第3～7天次黃嘌呤灌胃加冰敷組的改變最為明顯。第2～7天，次黃嘌呤灌胃加冰敷組對比冰敷組也有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。圖1中顯示了第1～10天各組大鼠左右膝關節(jié)橫向最大徑差值的組內平均值和標準差。

圖1 不同時相各組大鼠左右膝關節(jié)橫向最大徑差值比較

2.2 各組大鼠步態(tài)評分比較

正常組、次黃嘌呤灌胃組和冰敷組大鼠在實驗期間步態(tài)均無異常，僅次黃嘌呤加冰敷組大鼠在實驗第3～6天出現(xiàn)輕度跛行，第1～6天步態(tài)評分分別為：0、（0.5±0.55）、（1.5±0.55）、（1.8±0.4）、（1.8±0.4）、（1.7±0.52）分。第7天開始，該組大鼠在冰敷后出現(xiàn)明顯身體不良反應，如食欲不振、腹瀉、毛發(fā)豎立、活動減少等。冰敷后數(shù)小時內，該組大鼠多俯臥不動，刺激無效，故難以判斷步態(tài)，而且從偶爾站立情況來看，左右下肢并無顯著差異。因此，從第7～10天，次黃嘌呤加冰敷組大鼠步態(tài)評分都記為零。

2.3 大鼠關節(jié)形態(tài)學檢查

為了觀測重復次黃嘌呤灌胃加冰敷對大鼠膝關節(jié)是否可造成長期影響，在停止灌胃和冰敷3d后，再次檢測該組大鼠右下肢膝關節(jié)腫脹程度和步態(tài)，并以戊巴比妥鈉麻醉后暴露右下肢膝關節(jié)進行形態(tài)學檢測。結果發(fā)現(xiàn)關節(jié)腫脹消失，步態(tài)正常，鏡下形態(tài)學特征與正常關節(jié)無差異。

3 討論

人類易發(fā)痛風是因長期高嘌呤飲食和體內缺乏尿酸酶等因素導致的嘌呤代謝紊亂、高尿酸血癥，最終尿酸鹽因飽和在組織內沉積而引起［1］。哺乳類實驗動物體內都含有尿酸酶，可迅速將體內過多的尿酸代謝為水溶性良好并無毒的尿囊素隨尿液排出體外，因此通過高尿酸血癥誘發(fā)痛風動物模型極為困難［11］。考慮到低溫環(huán)境對痛風性關節(jié)炎的誘發(fā)作用，而國內亦有通過單純低溫處理小鼠膝關節(jié)制備骨性關節(jié)炎動物模型的先例［12］，筆者設計以次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型為基礎，并在灌胃后立即對大鼠右下肢膝關節(jié)持續(xù)冰敷3h以促發(fā)尿酸鹽在低溫局部析出結晶，從而建立急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型。次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型可致血尿酸水平短時間內達到500μmol／L左右［9］，而尿酸鹽在30oC時的最大溶解度不足300μmol／L［13］，若不考慮大鼠關節(jié)腔內組織液與血液間尿酸鹽濃度的差異，則以局部冰敷促使膝關節(jié)內發(fā)生尿酸鹽結晶在理論上是可行的。

實驗結果表明單純次黃嘌呤灌胃組大鼠對比正常對照組未出現(xiàn)腫脹和步態(tài)異常。而冰敷組大鼠膝關節(jié)在每次冰敷后都有一定程度腫脹，雖然與正常對照組有統(tǒng)計學差異，但腫脹程度并不明顯，可能與低溫導致的關節(jié)水腫和炎癥反應有關［12］。冰敷組大鼠并未表現(xiàn)顯著的步態(tài)異常。雖然文獻有通過持續(xù)低溫刺激膝關節(jié)30d建立骨性關節(jié)炎小鼠模型的報道，但在本實驗的實際操作中卻發(fā)現(xiàn)諸多不便。其一，未經(jīng)過麻醉將動物固定并暴露單側膝關節(jié)進行長時間冰敷實際對動物是一種制動，對后期行為學評價有影響；其二，操作有困難，大鼠膝關節(jié)部位較小，冰敷范圍難以控制；其三，冰敷組大鼠在重復多天冰敷后出現(xiàn)明顯身體不適，如活動力下降、腹瀉和食欲減退等，說明該操作不可長期持續(xù)，否則會嚴重影響對結果的評價。本實驗中，冰敷組大鼠持續(xù)冰敷10d，對比次黃嘌呤灌胃加冰敷組，未出現(xiàn)死亡和嚴重不良反應，但都有輕微不適，在停止實驗3d后都恢復正常。

次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右下肢膝關節(jié)的腫脹程度，與其它實驗組之間都存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），尤以第3～6天最為顯著（見圖1）。而步態(tài)評分亦顯示該組大鼠在第3～6天的活動障礙最為明顯，至少表現(xiàn)為輕度跛行，多數(shù)大鼠表現(xiàn)為中度跛行。在實驗過程中，從第1～10天，關節(jié)腫脹程度隨著實驗進程有明顯波動，出現(xiàn)一定的時間依賴性，這可能與高尿酸血癥建模中尿酸在實驗動物體內累積的濃度有關［10］。在一定范圍內，痛風性關節(jié)炎的嚴重程度應與血尿酸濃度呈正相關。當血尿酸濃度達到或超過尿酸的飽和度后即可析出并誘發(fā)急性痛風性關節(jié)炎，且嚴重程度會隨濃度的增加而加重。如圖1所示，血尿酸濃度應在第五天達高峰值，而后會隨著尿酸酶的代償性增多和活化而逐漸下降，最終與冰敷組相似。因此，在后期建模中加入尿酸酶抑制劑（如氧嗪酸）可能會有更好的效果9。

由于次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在第10天出現(xiàn)2例死亡（2／6），所以被迫停止實驗。停止實驗3d后該組其它大鼠各項觀測數(shù)據(jù)比較正常組均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），鏡下檢查大鼠關節(jié)軟骨組織形態(tài)亦無差異，說明實驗組大鼠已完全恢復，未能誘發(fā)慢性痛風性關節(jié)炎。這可能是因為大鼠本身具備尿酸酶，可以很好的矯正高尿酸血癥和清除沉積的尿酸結晶。初步認為，如果無法建立穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型就難以建立以此為基礎的慢性痛風性關節(jié)炎動物模型。

綜上所述，重復次黃嘌呤灌胃和低溫處理大鼠膝關節(jié)可誘發(fā)大鼠急性痛風性關節(jié)炎模型，與其它現(xiàn)有動物模型相比更符合人類痛風的發(fā)病機制。該模型完全模擬人類由高嘌呤膳食和低溫環(huán)境誘發(fā)的痛風性關節(jié)炎發(fā)病機制，且避免了關節(jié)腔注射等外界干擾因素，更適用于目前對急性痛風性關節(jié)炎的相關基礎和臨床研究，也可成為建立完美的痛風性關節(jié)炎動物模型的基礎。

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