IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響

范雙莉，任亞麗

(濟源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濟源459000)

幽門括約肌是幽門環(huán)形肌在幽門處明顯增厚形成的，能夠控制食物在胃內(nèi)消化停留的時間以及排往十二指腸的速度，從而防止胃排空過快，拮抗十二指腸胃反流。這一作用主要是依賴幽門括約肌的持續(xù)張力產(chǎn)生的靜息壓和周期性收縮產(chǎn)生的收縮壓來實現(xiàn)和維持的。幽門括約肌的收縮活動主要依賴細胞內(nèi)Ca2+的介導(dǎo)。細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)由細胞膜鈣通道、鈣泵、肌漿網(wǎng)的鈣攝取和釋放以及Na+－Ca2+交換體的參與。文獻報道，IL－1β可通過上皮依賴機制舒張雜種狗支氣管平滑肌［1］，其還可通過調(diào)節(jié)NO信號途徑，劑量和時間依賴性抑制大鼠血管平滑肌收縮，IL－1β抑制平滑肌收縮的作用與NO信號途徑有關(guān)。IL－1β能否抑制幽門括約肌的自發(fā)收縮，目前尚少見報道。因此，本實驗通過觀察IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響，初步探討其作用機制，為IL－1β在平滑肌舒張方面的作用機制進行補充，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 實驗資料

1.1 主要試劑與儀器 IL－1β，ProSpec;亞甲基藍，Amresco;L－NAME，Sigma。RM6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠;換能器，成都儀器廠;恒溫浴槽，成都儀器廠;灌流槽，成都儀器廠;倒置解剖顯微鏡，LeicaDMIL。

1.2 實驗動物 SPF級成年SD大鼠80只(河南省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(豫)(2010－0002))，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不拘。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠離體幽門括約肌標本制備 實驗前禁食24 h，自由飲水。實驗時頸椎脫臼快速處死，打開腹腔，暴露胃底，分離幽門周圍組織，立即離體幽門括約肌，放入有Krebs液的培養(yǎng)皿中洗去內(nèi)容物。在解剖顯微鏡下清除周圍組織，制備成幽門括約肌條，長10 mm、寬2 mm［2］。在肌條兩端分別穿雙股棉線，一端棉線懸掛于不銹鋼鉤，固定在灌流槽的底部，另一端棉線與張力換能器相連，連接到RM6240C型生物信號采集系統(tǒng)，記錄張力－效應(yīng)曲線。根據(jù)長度－張力曲線，給予1 g前負荷，使肌條拉伸至最適長度。標本在灌流槽中穩(wěn)定40 min，10 min換Krebs液1次，肌條出現(xiàn)自發(fā)收縮，觀察自發(fā)收縮曲線，待標本活動穩(wěn)定后，進行實驗。實驗過程中，肌條所在溶液中持續(xù)供應(yīng)95%O2和5%CO2的混合氣體，同時，灌流槽內(nèi)溫度維持在37℃。

1.3.2 實驗分組與處理 標本分為正常組、IL－1β組、亞甲基藍組、L－NAME組。

1.3.2.1 正常組實驗處理 離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，持續(xù)記錄張力－效應(yīng)曲線，觀察無任何處理時幽門括約肌的收縮振幅、頻率、張力的變化。

1.3.2.2 IL－1β組實驗處理 離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，自發(fā)收縮基本平穩(wěn)，分別加入終濃度為2，20，200μg/L的IL－1β溶液，觀察不同濃度的IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，記錄濃度－效應(yīng)曲線。IL－1β作用60 min后，Krebs液沖洗標本3次，每次10 min，直至標本自發(fā)收縮回復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)。

1.3.2.3 亞甲基藍組和L－NAME組實驗處理 2組離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，分別加入終濃度為2×10－6mol/L的亞甲基藍、100×10－6mol/L的 L－NAME，孵育 30 min，每組中分別加入終濃度為2，20，200μg/L的 IL－1β 溶液，記錄各組張力－效應(yīng)曲線60 min。觀察不同藥物孵育后，IL－1β對離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響。實驗結(jié)束后，Krebs液沖洗標本3次，每次10 min，直至肌條回復(fù)至穩(wěn)定水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 IL－1β的效應(yīng)曲線由RM6240C型生物信號采集處理系統(tǒng)獲得，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，t’檢驗進行組間、組內(nèi)的顯著性差異比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮情況 大鼠離體幽門括約肌肌條在浴槽中平衡一段時間后，肌條開始出現(xiàn)自發(fā)收縮，將無自發(fā)收縮波或自發(fā)收縮張力較小(＜1 g)的標本舍棄，持續(xù)記錄大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮曲線60 min，見圖1，其收縮的振幅為(0.44±0.01)g，頻率為(3.91±0.08)次/min，張力為(1.27±0.02)g。

圖1 大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮曲線

2.2 不同濃度的IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 不同濃度的IL－1β孵育60 min，大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均被抑制，見表1。

表1 IL－1β組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表1 IL－1β組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.05;②與本組給藥前比較，P＜0.01。

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2.3 亞甲基藍作用下IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 與IL－1β組相比，亞甲基藍組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均不同程度的增加，見表2。

2.4 L－NAME作用下IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 與IL－1β組相比，L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均不同程度的增加，即IL－1β對大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的抑制作用被LNAME部分抵消，見表3。

表2 亞甲基藍組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表2 亞甲基藍組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.01。

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3 討 論

幽門括約肌的主要作用在于控制食物在胃內(nèi)消化停留的時間以及排往十二指腸的速度，從而防止胃排空過快，并抗十二指腸胃反流。這一作用主要依賴幽門括約肌的持續(xù)張力產(chǎn)生的靜息壓和周期性收縮產(chǎn)生的收縮壓來實現(xiàn)和維持。幽門括約肌異常會引起多種疾病，如先天性肥厚性幽門狹窄會引起小兒嘔吐而不能進食，進而產(chǎn)生全身性營養(yǎng)不良、脫水及酸中毒等［3］。幽門管潰瘍［4］、幽門梗阻［3］等疾病的發(fā)生也與幽門括約肌的收縮與舒張緊密關(guān)聯(lián)。

幽門括約肌的運動受多種因素的調(diào)控，包括神經(jīng)因素，體液因素和局部激素等。其中主要因素是神經(jīng)因素和體液因素，然而無論是神經(jīng)因素還是體液因素引起的幽門括約肌收縮，最終都要依賴細胞內(nèi)的Ca2+的介導(dǎo)，細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)由細胞膜鈣通道、鈣泵、細胞器的鈣攝取和釋放以及Na+－Ca2+交換體的參與。有文獻報道，影響平滑肌張力的因素有:二酰甘油/蛋白激酶C信號系統(tǒng)、IP3/Ca2+信號系統(tǒng)、細胞內(nèi)cAMP和cGMP的含量以及鉀離子通道的開放狀態(tài)［5］。

IL－1家族是炎癥反應(yīng)的重要標志物質(zhì)，包括IL－1、IL－1受體和IL－1受體拮抗劑(IL－A ra)等，主要由成纖維細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生，是機體內(nèi)重要的炎癥遞質(zhì)，對免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)等具有極其廣泛的生物學(xué)作用。文獻報道，IL－1主要以兩種形式存在:IL－1α和IL－1β，二者雖然具有不同的氨基酸序列，但其三維空間結(jié)構(gòu)相似，都能夠與同一細胞表面的受體結(jié)合，且與靶細胞上的IL－1受體的親和力相同［6］。IL－1α和IL－1β分別與其受體結(jié)合，通過G蛋白耦聯(lián)機制發(fā)揮作用IL－1β通過促進前列腺素的合成及其分泌而發(fā)揮作用:也可以依賴花生四烯酸，或誘導(dǎo)合成其他花生四烯酸物質(zhì)(如PGE2)，進而引起發(fā)熱，IL－1β還可以與其他細胞因子(如IFN/TNF)聯(lián)合，誘導(dǎo)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量誘生型一氧化氮合酶，進而增加NO 的產(chǎn)生［7－8］。

目前研究幽門括約肌自發(fā)收縮活動的實驗方法有在體實驗和離體實驗。離體實驗簡單易操作，對實驗條件的要求較在體實驗容易控制，而且重現(xiàn)性較好，是分析性研究較常用的一種手段，是研究藥物作用機制的有效方法。

本研究采用離體組織灌流的方法，結(jié)果表明，IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，表現(xiàn)為收縮的振幅、頻率和張力均下降。平滑肌的收縮活動改變的最終原因歸結(jié)為細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，說明IL－1β能夠降低幽門括約肌細胞內(nèi)的鈣離子濃度。

表3 L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表3 L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.01。

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為了確定IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮是否與NO有關(guān)，本研究選取了L－NAME進行實驗。L－NAME能夠競爭性抑制一氧化氮合成酶(NOS)，從而降低NOS的生物學(xué)效能，是一種非選擇性的一氧化氮合成酶抑制劑。NOS主要以L－精氨酸為底物催化內(nèi)源性NO的合成。脂溶性小分子NO是一種氣態(tài)的第二信使，在體內(nèi)多種細胞中均有產(chǎn)生，且具有顯著的生物活性，如促進遞質(zhì)釋放、舒張平滑肌、參與突觸可逆性過程等。研究表明，NO能夠直接通過平滑肌細胞膜與GC上的鐵離子結(jié)合，進而催化cGMP的生成［9］，最終導(dǎo)致平滑肌舒張。本實驗結(jié)果顯示L－NAME能部分抵消IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，說明IL－1β的作用機制與NO有關(guān)。為了進一步確定IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮是否與細胞內(nèi)的cGMP有關(guān)，本研究選擇了亞甲基藍進行阻斷。亞甲基藍是胞漿可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的一種抑制劑，而胞漿可溶性鳥苷酸環(huán)化酶是催化cGMP生成的重要活性酶。GTP在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的作用下發(fā)生環(huán)化，進而生成cGMP，cGMP與平滑肌上的依賴cGMP的蛋白激酶G(PKG)結(jié)合并使之激活，通過對底物蛋白的磷酸化發(fā)揮生理功能，如活化的PKG能引起鈣通道的磷酸化，也可以引起ADPR環(huán)化酶的磷酸化增強其活性進而催化生成RyR的生理性配體——cADPR，這些作用都能降低細胞中鈣離子濃度，導(dǎo)致平滑肌舒張［10］。本研究結(jié)果顯示，亞甲基藍能部分抵消IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，這進一步表明，IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮與細胞內(nèi)cGMP的含量有關(guān)。

綜上所述，IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，其作用機制可能與cGMP、NO有關(guān)。

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