MBP促進(jìn)出血性卒中大鼠康復(fù)的作用機(jī)制研究

袁 宇，郭 毅，李春暉，史彥芳，胡福廣

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊050000)

出血性卒中占全部腦卒中的20%～30%，病死率和致殘率高，是危害人類健康的主要疾病之一。在全球，每年有數(shù)千萬(wàn)人罹患出血性卒中，其中35%～52%的病例在1個(gè)月內(nèi)死亡，病情加重的主要原因是出血后的繼發(fā)性腦損害，因此如何阻斷繼發(fā)性腦損害的發(fā)生成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。免疫系統(tǒng)在損害擴(kuò)散過程中的作用一直存有爭(zhēng)議，一方面抗炎性化合物，如甲基潑尼松龍?jiān)趧?chuàng)傷后早期階段具有對(duì)抗損傷蔓延的作用;另一方面炎性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)又是損傷神經(jīng)纖維修復(fù)所需要的。此前研究證實(shí)，髓鞘堿性蛋白(MBP)免疫治療對(duì)缺血性腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷均有保護(hù)作用［1］。本研究應(yīng)用大鼠出血性卒中模型，通過觀察腦組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的免疫組化表達(dá)和脾臟中Foxp3 mRNA的表達(dá)，探討MBP免疫治療對(duì)出血性卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康成年雌性SD大鼠(動(dòng)物由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自然晝夜節(jié)律，自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng))60只，體質(zhì)量(300±20)g。采用隨機(jī)數(shù)字表分為MBP組、卵白蛋白(OVA)組、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)組各20只。根據(jù)干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的不同，每組分為5個(gè)亞組，每組4只大鼠。1.2 試劑和儀器 MBP抗原、OVA抗原、不完全弗式佐劑(IFA)購(gòu)自Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、瓊脂糖(agarose)及 Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)由Promega公司提供。GFAP兔抗大鼠多克隆抗體及BDNF兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。目的基因Foxp3的引物合成序列根據(jù)Poussier等［2］的方法設(shè)計(jì)，F(xiàn)oxp3引物序列:上游引物為5’-TGCATCAGCTCTCCACTGTAGACGCA-3’，下游引物為 5’-CGCTCAGGTACACCCAGGAAAGACAG-3’，大鼠 β-actin引物序列:上游為5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，下游為5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’，上海生物工程公司合成。NARISHIGE SR-6N型腦立體定向儀(日本)，GeneAmp 9600型PCR儀(美國(guó)PE公司)。

1.3 大鼠腦出血模型的制備 按照張祥建等［3］大鼠自體動(dòng)脈血腦出血造模方法建立模型。

1.4 行為學(xué)評(píng)分 參照Longa五級(jí)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0級(jí):無體征，記0分;Ⅰ級(jí):動(dòng)物不能完全伸直其前肢，計(jì)1分;Ⅱ級(jí):動(dòng)物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，計(jì)2分;Ⅲ級(jí):動(dòng)物不能站立、打滾，計(jì)3分;Ⅳ級(jí):無自發(fā)性活動(dòng)，有意識(shí)障礙，計(jì)4分［4］。造模成功12 h后，評(píng)分為2分大鼠入組。每天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。

1.5 主動(dòng)免疫 腦出血模型建立后12 h，分別取IFA乳化的MBP、VOA、PBS于大鼠右下肢皮下注射，用量MBP 300μg/只，VOA 200 μg/只，PBS 200 μg/只。

1.6 標(biāo)本取材 免疫后1，3，7，14，21 d對(duì)各組動(dòng)物取材。10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉。胸腹腔聯(lián)合切開，摘除脾臟，置凍存管中-80℃液氮保存。斷頭取腦，石蠟包埋，4μm連續(xù)冠狀切片，取3張連片，分別做GFAP、BDNF免疫組織化學(xué)反應(yīng)和HE染色。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)Foxp3 mRNA 取脾臟組織100 mg，提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)提取RNA完整性，目的基因PCR擴(kuò)增，同時(shí)擴(kuò)增鼠β-actin用作內(nèi)參照，RT-PCR產(chǎn)物半定量分析，計(jì)算Foxp3與β-actin的相對(duì)密度值，以此代表目的片斷相對(duì)表達(dá)值。

1.8 GFAP、BDNF免疫組化觀察 分別按操作說明進(jìn)行，結(jié)果以胞漿清晰、棕色著色顆粒為陽(yáng)性，細(xì)胞無棕色染色顆粒為陰性。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)物灰度值和陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，標(biāo)準(zhǔn)如下:A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)，0～1%=0，＞1%～10%=1，＞10%～50%=2，＞50%～80%=3，＞80%～100%=4，B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)，0為陰性、1為弱陽(yáng)性、2為陽(yáng)性、3為強(qiáng)陽(yáng)性，免疫組化評(píng)分(HIS)=A×B。

2 結(jié) 果

2.1 模型建立成功 在注射自體動(dòng)脈血液后，大鼠迅速出現(xiàn)行為和功能異常，表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，飲食下降，皮毛欠光澤，一側(cè)肢體不同程度的癱瘓，追尾現(xiàn)象明顯，嚴(yán)重者動(dòng)物不能站立、打滾，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)意識(shí)障礙，其功能異常程度與病變嚴(yán)重程度一致。腦組織標(biāo)本可見明顯的血腫占位，提示模型建立成功。

2.2 行為學(xué)評(píng)分 MBP組Longa行為學(xué)評(píng)分顯著低于OVA組和PBS組，見表1。

表1 3組間Longa行為學(xué)評(píng)分比較(±s，分)

表1 3組間Longa行為學(xué)評(píng)分比較(±s，分)

注:①與MBP組比較，P＜0.05。

OVA組 2.16±0.22① 2.67±0.18① 1.31±0.42① 0.87±0.16①0.00±0.0

2.3 免疫組化

2.3.1 GFAP的免疫組化結(jié)果 在光鏡下，MBP組和PBS組大鼠在腦出血后，腦組織血腫周圍即可見GFAP表達(dá)，染色較均勻，結(jié)構(gòu)完整的GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞呈蜘蛛樣，胞體肥大，胞漿呈顆粒狀、增粗，血腫周邊區(qū)表達(dá)明顯，見圖1及圖2。大鼠腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化評(píng)分看，MBP組明顯高于PBS組及OVA組(P均＜0.01)，PBS組和OVA組比較無顯著性差異，見表2。

圖1 MBP組腦出血大鼠治療后GFAP的表達(dá)(×400)

2.3.2 BDNF的免疫組化結(jié)果 在光鏡下，MBP組和PBS組大鼠腦出血后腦組織血腫周圍即可見BDNF胞漿棕染的陽(yáng)性細(xì)胞，免疫陽(yáng)性細(xì)胞可見神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，見圖3及圖4。大鼠腦組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化評(píng)分，MBP組明顯高于OVA組及PBS組比較有顯著性差異(P均＜0.05)，PBS組和OVA組比較無顯著性差異，見表3。

圖2 PBS組腦出血大鼠治療后GFAP的表達(dá)(×400)

表2 3組出血周圍腦組織中GFAP的表達(dá)情況(±s)

表2 3組出血周圍腦組織中GFAP的表達(dá)情況(±s)

注:①與MBP組比較，P＜0.01。

?

圖3 MBP組腦出血大鼠治療后BDNF的表達(dá)(×400)

圖4 PBS組大鼠腦出血治療后BDNF的表達(dá)(×400)

表3 3組出血周圍腦組織中BDNF的表達(dá)情況(±s)

表3 3組出血周圍腦組織中BDNF的表達(dá)情況(±s)

注:①與MBP組比較，P＜0.05。

?

2.4 Foxp3 mRNA的表達(dá) MBP組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達(dá)在1 d、3 d、7 d、14 d明顯低于PBS組和OVA組(P均＜0.01)，且在7 d時(shí)表達(dá)最低，在21 d時(shí)MBP組與對(duì)照組數(shù)值較接近，但仍有顯著性差異(P＜0.05)。PBS組和OVA組比較無顯著性差異。見圖5、圖6及表4。

圖5 MBP組大鼠脾臟T細(xì)胞Foxp3 mRNA電泳圖

圖6 PBS組大鼠脾臟T細(xì)胞Foxp3 mRNA電泳圖

表4 3組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達(dá)情況(±s)

表4 3組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達(dá)情況(±s)

注:①與BMP組比較，P＜0.01。

組別1d 3d 7d 14d 21d MBP組 0.454±0.08 0.273±0.05 0.146±0.06 0.462±0.03 0.537±0.06 PBS組 0.736±0.09① 0.674±0.11① 0.619±0.04① 0.586±0.06① 0.651±0.05①OVA組 0.695±0.06① 0.643±0.05① 0.705±0.09① 0.601±0.11① 0.565±0.06①

3 討 論

腦損傷后積極進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)治療，對(duì)于減輕患者癥狀、降低病死率與致殘率都有著重要意義［5］。對(duì)于出血性卒中，中醫(yī)治療可以采用辨證論治、通腑瀉熱、宜通臟腑、通利九竅等治療［6］，西醫(yī)臨床上除運(yùn)用傳統(tǒng)手術(shù)、脫水藥物及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等藥物外，治療手段較少。本研究試圖應(yīng)用MBP主動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠，以探討免疫學(xué)方法在治療腦出血中的應(yīng)用價(jià)值。

大鼠在對(duì)抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有鞘軸突損傷的能力，來源于T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性自身免疫能力，該能力被有髓特異性T細(xì)胞所提呈。當(dāng)應(yīng)用MBP去免疫出生動(dòng)物時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其在成年時(shí)不會(huì)發(fā)生對(duì)髓鞘蛋白的保護(hù)性免疫反應(yīng)，致使損傷相比普通動(dòng)物重。MBP是神經(jīng)髓鞘的一種特有膜蛋白，在顱內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)損傷累及髓鞘時(shí)可在腦脊液及血清中檢出。Kipnis［7］研究發(fā)現(xiàn)，MBP可提高視神經(jīng)損傷后殘余神經(jīng)元的免疫作用，證實(shí)了MBP自身免疫對(duì)中樞神經(jīng)的免疫保護(hù)作用，對(duì)于MBP反應(yīng)的T細(xì)胞過激轉(zhuǎn)移或用髓磷脂有關(guān)抗原主動(dòng)免疫，通過保護(hù)損傷灶外周的神經(jīng)細(xì)胞，可以促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷的恢復(fù)。

在腦組織中的GFAP為神經(jīng)膠質(zhì)纖維所特有的一種中間絲蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，GFAP作為一種細(xì)胞骨架，具有一定的對(duì)抗損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，MBP組大鼠腦組織中GFAP的表達(dá)明顯高于OVA組及PBS組。BDNF在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，也是神經(jīng)元執(zhí)行正常功能和維持活性所必需的，其可通過為損傷神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)而促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后的運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元的恢復(fù)。本研究中觀察到，3組在腦出血后血腫周圍可見零星的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞的密度和染色深度均較其他側(cè)高，陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，呈圓形或橢圓形，未見突起，胞漿淺棕色，腦出血后，血腫區(qū)內(nèi)出現(xiàn)呈弱陽(yáng)性的吞噬細(xì)胞，血腫周圍細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)。MBP組在相應(yīng)時(shí)間BDNF的表達(dá)高于OVA組及PBS組。結(jié)合各組腦出血大鼠行為學(xué)的觀察對(duì)比，表現(xiàn)出了MBP對(duì)出血性卒中的腦保護(hù)作用。

Foxp3是義頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，其表達(dá)及功能與調(diào)節(jié)性CD4+CD25+Treg細(xì)胞密切相關(guān)，在信使RNA及蛋白水平表達(dá)Foxp3陽(yáng)性的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，其數(shù)量的增減與對(duì)機(jī)體的免疫抑制功能提高和減退呈現(xiàn)相關(guān)性［8］。作為一個(gè)特異CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的Foxp3，通過監(jiān)測(cè)其變化就能反映CD4+CD25+Treg抑制功能改變。最近研究表明，去除了天然CD4+CD25+Treg(含總數(shù)10%的CD4+)，導(dǎo)致動(dòng)物造成易患器官特殊性免疫疾病的因素［9］。通常自身免疫是被自然存在的調(diào)節(jié)性CD4+CD25+Treg細(xì)胞所抑制的，如果減弱了對(duì)有可能的神經(jīng)元退變起保護(hù)作用的自身免疫抑制，那么受損的中樞神經(jīng)的神經(jīng)元就會(huì)受到保護(hù)［10］，也就是說，CD4+CD25+Treg的缺失促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的存活。在多發(fā)性硬化綜合征(MS)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中，其發(fā)病機(jī)制都是由于對(duì)自身反應(yīng)性抗原MBP等過激的免疫性損傷造成的，而在中樞神經(jīng)損傷后，針對(duì)MBP適度的免疫反應(yīng)，其結(jié)果就是免疫保護(hù)作用，二者具有極相近的免疫反應(yīng)機(jī)制［11］。本實(shí)驗(yàn)中MBP組大鼠脾臟的Foxp3 mRNA表達(dá)較PBS組及OVA組顯著減低，表現(xiàn)出了MBP對(duì)CD4+CD25+Treg的抑制作用，從而對(duì)神經(jīng)元的退變起到了保護(hù)作用。

本研究顯示，MBP組大鼠的行為學(xué)評(píng)分較PBS組及OVA組低，腦組織內(nèi)GFAP和BDNF免疫組化表達(dá)較PBS組及OVA組顯著增強(qiáng)，大鼠脾臟的Foxp3 mRNA表達(dá)較PBS組及OVA組顯著減低，提示MBP作為自身蛋白在主動(dòng)免疫大鼠后起到了保護(hù)作用。其免疫保護(hù)作用機(jī)制為通過下調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用，使效應(yīng)細(xì)胞作用上調(diào)，最終使星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性增強(qiáng)，表達(dá)GFAP和BDNF增強(qiáng)，從而促進(jìn)出血性卒中大鼠的受損腦組織的康復(fù)。

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