miR－21和miR－93聯(lián)合檢測(cè)在三陰性乳腺癌診斷中的價(jià)值

傅少梅，殷初陽(yáng)，宋 暉

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海200011)

三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子的受體(HER－2)均為陰性的乳腺癌，具有發(fā)病年齡早、惡性程度高、易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)［1－2］。在治療策略中并不能從乳腺癌內(nèi)分泌和靶向治療獲益。微小RNA(miRNA)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有研究表明miR－21和miR－93參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究探討了miR－21和miR－93與TNBC的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2006年1月—2012年12月在我院行乳腺癌根治術(shù)的女性患者33例，均行免疫組化檢測(cè)證實(shí)為TNBC，術(shù)前均未行放療或者化療。年齡23～62(45．73±8.83)歲，腫瘤直徑 1．0 ～14．0(5．32 ±1．32)cm;月經(jīng)情況:絕經(jīng)前10例，絕經(jīng)后23例;臨床分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期11例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。并選取同期正常乳腺組織15例。本組實(shí)驗(yàn)獲取的標(biāo)本均獲得患者的知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器及試劑 Trizol試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，Prime-Script RT reagent kit購(gòu)自武漢博士德公司，miRNA Real－time PCR Kit購(gòu)自吉瑪公司;PCR儀購(gòu)自美國(guó)Biorad，微量加樣器購(gòu)自德國(guó)Eppendoff公司。

1.3 RT－PCR檢測(cè) 采用總RNA提取試劑Trizol提取標(biāo)本組織中的總RNA;取1μL總RNA、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0．5μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;取模板 cDNA 2．5 μL，聚合酶 Ex Taq HS0．1 μL，上游引物0．1μL，下游引物0．1μL進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min，而后94℃變性40 s，50～65℃退火40 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min，1個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物－20℃冰箱保存。每組均以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，并按上述方法分管進(jìn)行擴(kuò)增;配制2%瓊脂糖凝膠;取PCR產(chǎn)物6μL，2%瓊脂糖凝膠電泳120 V，100 mA，30 min。電泳結(jié)束后，取出凝膠置于EB液中約5 min，取出凝膠。電泳條帶中符合預(yù)期的大小片段判定為PCR陽(yáng)性條帶。應(yīng)用Quantity One software(Bio－Rad Inc)軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰度掃描。以目的基因與內(nèi)參照(GAPDH)的灰度比值作為mRNA產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。miR－21引物序列為sense:5’－TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT－3’，antisense:5’－CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT－3’;miR－93引物序列為sense:5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’，antisense:5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’;GAPDH 引物序列為 sense:5’－CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA －3’，antisense:5’－GGGTGGAATACATTGGAACATGT－3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，獨(dú)立2組變量的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR－21和miR－93在TNBC組織和正常乳腺組織中的表達(dá) miR－21和miR－93在TNBC組織中的相對(duì)表達(dá)量為0．874 ±0．124 和0．764 ±0．163，在正常乳腺組織中的表達(dá)量為0．235±0．034 和0．183 ±0．028，TNBC 組織中的 miR －21和miR－93表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織(P＜0．01)。

2.2 miR－21和miR－93在TNBC組織表達(dá)與病理的關(guān)系miR－21和miR－93相對(duì)表達(dá)量分別為0．874和0．764，以此為界，≥平均值為高表達(dá)，＜平均值為低表達(dá)。分析顯示miR－21和miR－93基因的高表達(dá)與年齡、月經(jīng)狀態(tài)無(wú)明顯相關(guān)性，而與腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性(P ＜0．05或0．01)。見(jiàn)表1。

2.3 TNBC組織中miR－21和miR－93表達(dá)的相關(guān)性 TNBC組織中miR－21和miR－93均為高表達(dá)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)(r=0．732，P ＜0．01)。

3 討 論

miRNA是一種高度保守的小分子RNA片段，在機(jī)體中可有調(diào)控抑癌基因和癌基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用［4－5］。miR－21在結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)［6－7］，其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到癌基因的作用，其靶基因很有可能是抑癌基因。在靶基因的預(yù)測(cè)顯示，腫瘤的抑癌基因如TIMP3、PDCD4和BCL－2可能為其靶基因。有研究表明抑制MCF－7細(xì)胞的miR－21的表達(dá)有助于細(xì)胞的凋亡，并發(fā)現(xiàn)其潛在的靶基因PDCD4可能是抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的抑癌基因［8－9］。故miR－21在乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中具有重要作用，并影響患者的預(yù)后。本研究表明TNBC組織中的miR－21表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，并且其高表達(dá)與腫塊大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性，說(shuō)明miR－21在TNBC的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要聯(lián)系。由于靶基因的相對(duì)性，miR－21在TNBC的真正角色還需進(jìn)一步研究。

表1 miR－21和miR－93在TNBC組織表達(dá)情況與病理的關(guān)系

miR－93作為 miR106b－25簇的一個(gè)成員，定位在MCM7基因的第13號(hào)內(nèi)含子內(nèi)。其在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中具有高表達(dá)，在這些腫瘤中具有抑癌基因的功能，但在大腸癌中卻表現(xiàn)為低表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性［10］。有研究表明高表達(dá)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和毛細(xì)血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［3］。本研究表明TNBC組織miR－93的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，并且其表達(dá)與腫瘤的大小、腫瘤的分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性，故認(rèn)為miR－93可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。其促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制與其靶基因即整合素β－8具有明顯相關(guān)性，通過(guò)抑制整合素β－8的表達(dá)，miR－93促進(jìn)血管的生成和腫瘤的生長(zhǎng)［11－12］。

現(xiàn)有資料表明大量的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因的網(wǎng)絡(luò)參與了TNBC的形成過(guò)程，其涉及多個(gè)基因，多種細(xì)胞因子參與其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。本研究表明miR－21和miR－39在TNBC組織的表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。隨著miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究的突破，進(jìn)一步弄清miR－21和miR－39之間的關(guān)系，并建立進(jìn)一步的基因治療策略將成為可能，必將為TNBC的早期診斷和治療以及療效評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷提供重要的理論依據(jù)。

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