滅幽湯對幽門螺桿菌相關性胃炎脾胃濕熱證小鼠 AQP4、IL-6、IL-8 的影響*

郭 璇 羅 燕喻 斌 王小娟△ 杜中華 夏 蓉 尹 姣

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

脾胃濕熱證是慢性胃炎中最常見的實證，幽門螺桿菌（Hp）是導致胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌的主要致病因子［1-2］。水通道蛋白（AQPs）作為在多種器官組織的細胞膜上存在著的一種整合蛋白質(zhì)，可控制水在細胞的進出，在機體水液轉(zhuǎn)運和代謝中發(fā)揮重要作用。水通道蛋白4（AQP4）是AQPs蛋白家族成員之一，在化學誘導損傷胃黏膜后，AQP4在維持胃黏膜完整性中起重要作用［3］。滅幽湯是臨床治療Hp相關性脾胃濕熱型慢性胃炎的經(jīng)驗方［4-8］。本研究通過施加濕熱生存環(huán)境、Hp細菌感染、肥甘飲食的方法復制脾胃濕熱證BALB/c小鼠模型，從AQP4、白介素 （IL）-6、IL-8方面探討滅幽湯治療Hp相關性脾胃濕熱型慢性胃炎的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠70只，雌雄各半，8周齡［購自南京君科生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號：0017145，動物中心許可證號：SCXK（蘇）2011-0003］。飼料：普通飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，高脂飼料（普通飼料+8%蜂蜜+12%豬油）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司代加工。

1.2 Hp菌種 悉尼標準菌株 （SSI），SSI含有細胞毒素相關基因（cagA）蛋白和空泡細胞毒素（vacA），濃度為Hp菌液1×109cfu/mL，由湖南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病原免疫學教研室提供。

1.3 藥物 滅幽湯（黃芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陳皮、烏賊骨），以上藥材均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院鑒定，符合藥典標準；藥物浸泡30min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續(xù)煎煮20min，取汁另置。繼續(xù)加水，煎煮沸騰后，文火續(xù)煎20min，取汁。兩次藥汁合并后濃縮至每毫升含生藥2 g，并用離心機去除藥汁中殘渣，4℃保存。枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫(yī)藥出廠，生產(chǎn)批號：1212248。替硝唑由山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司出廠，國藥準字H20033090，生產(chǎn)批號121004?？死顾赜珊贾葜忻廊A東制藥有限公司出廠，國藥準字H10970216，生產(chǎn)批號121101。

1.4 儀器與試劑 膠體金法幽門螺桿菌檢測試劑盒，艾康生物技術（杭州）有限公司生產(chǎn)，批號：20123139。AQP4一抗購自武漢博士德生物工程有限公司，編號：BA1560，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司編號：SP9002。JY3002型電子天平購自上海精密科學儀器有限公司，HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋購自上海南陽儀器有限公司，LEICADM LB2型雙目顯微鏡購自德國LEICA公司，Shandon325型石蠟切片機英國Shandon公司產(chǎn)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司，Motic B5顯微攝像系統(tǒng)購自麥克奧迪實業(yè)集團公司，人工濕熱箱為本實驗室制作（現(xiàn)已申請專利）。

1.5 分組與造模 將70只BALB/c小鼠隨機分為滅幽湯高濃度組（滅高組）、滅幽湯低濃度組（滅低組）、胃三聯(lián)組、模型組、正常對照組。正常對照組予以普通飼料飼養(yǎng)，滅高組、滅低組、胃三聯(lián)組、模型組造模方法綜合廖瑩峰等對脾胃濕熱模型及Hp感染動物模型的報道建立［9-11］：予以高脂飼料飼養(yǎng)10 d后放入人工濕熱箱［溫度（32±2） ℃，濕度（95±1）%］內(nèi)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，于放入人工濕熱箱后的第15日以濃度為1×109cfu/mL Hp混懸液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h給食水。隔日感染1次，連續(xù)感染3次，感染后定植2周。2周后各組隨機抽取2只小鼠做病理切片觀察炎癥情況，模型組另取2只小鼠以膠體金法檢測血漿Hp抗體，做電鏡下觀察Hp定植情況。

1.6 給藥方法 滅高組、滅低組、胃三聯(lián)組在模型造模成功后開始給藥，按照小鼠與人體表面積計算比值換算公式，計算小鼠用藥劑量。胃三聯(lián)組予替硝唑+克拉霉素+枸櫞酸鉍鉀顆粒，用藥劑量為279.8 mg/kg；滅高組予滅幽湯，劑量為12.4 g/kg；滅低組予滅幽湯，劑量為6.2 g/kg。每日灌胃1次，其他組分別灌等量的蒸餾水。

1.7 標本采集與檢測 給藥后兩周摘眼球取血，Elisa檢測血清中IL-6、IL-8的含量。再脫頸處死小鼠，將小鼠仰臥位固定于鼠板，迅速取出胃標本。取胃前，將幽門部和賁門部結扎，在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈，放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，備做免疫組化檢測。免疫組化法檢測AQP4：蠟切片脫蠟水化，3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水洗3次；枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）高壓煮沸，蒸餾水沖洗，PBS洗滌2次，每次5min；山羊抗血清封閉15min；加入AQP4一抗，4℃，過夜；PBS漂洗3次，每次5min；加入SABC，室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，每次5min；顯色液顯色，鏡下觀察，待顯色完全后清洗，終止顯色反應；滴加蘇木素復染，流水漂洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹脂膠封片。使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對樣本圖像進行分析。每個樣本隨機選取3個高倍視野，計算黃褐色陽性表達的面密度（陽性表達總面積/統(tǒng)計區(qū)域總面積）表示，以此表示AQP4蛋白的表達，進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，符合正態(tài)性和方差齊性的資料，應用完全隨機化設計的方差分析、多重比較，不符合正態(tài)性和方差齊性，用秩和檢驗Kruskal-Wallis H檢驗，兩組比較用Wilcoxon檢驗和Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 造模結果 本研究從病因模擬建立Hp相關性胃炎脾胃濕熱證模型，從小鼠飲食、飲水、大小便及精神狀態(tài)結果分析，本實驗造模方法成功使模型組小鼠表現(xiàn)出食少納呆、少飲、大便溏、肢體困重等脾胃濕熱證癥狀，與2002年《中藥新藥臨床研究指導原則》中脾胃濕熱證辨證依據(jù)相符。光鏡下模型組小鼠胃黏膜多為充血腫脹，表面欠光整，腺體排列較紊亂，可見較多的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，未見糜爛，模型組符合慢性非萎縮性胃炎表現(xiàn)。綜上所述，濕熱環(huán)境、肥甘飲食及Hp定值綜合病因制造的脾胃濕熱證動物模型典型，在癥狀表現(xiàn)、病理檢查及驗方反證上均貼近臨床，造模方法可行。

2.2 各組小鼠胃組織病理改變 見圖1。光鏡下，正常組小鼠胃黏膜上皮細胞排列整齊，細胞呈單柱狀，固有層內(nèi)有密集排列的腺體，個別小鼠胃黏膜底部可見少量散在的淋巴細胞。模型組小鼠胃竇部的炎癥程度重，胃黏膜上皮排列紊亂，固有層內(nèi)可見大量淋巴濾泡、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，炎癥細胞甚至到達黏膜下層。滅低組炎癥程度明顯減輕，黏膜層少量炎性細胞浸潤，固有層僅有水腫，少量淋巴細胞。滅高組和胃三聯(lián)治療組胃黏膜上皮細胞排列整齊，炎癥幾乎全部消失。

圖1 各組小鼠胃組織病理改變

2.3 各組小鼠胃黏膜AQP4、血清IL-6、IL-8表達變化 見表1。（1）AQP4的表達：與正常對照組比較，小鼠模型組AQP4表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，滅高組、滅低組、胃三聯(lián)組小鼠AQP4表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。胃三聯(lián)組與滅高組中AQP4 降低，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（2）血清 IL-6、IL-8表達：對照組小鼠血清中有極少量IL-6、IL-8表達。與正常對照組比較，模型組IL-6、IL-8表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，滅高組、滅低組、胃三聯(lián)組小鼠IL-6、IL-8表達均明顯降低（P＜0.01）；高滅組 IL-6、IL-8低于滅低組（P＜0.05），說明滅幽湯質(zhì)量濃度影響其療效；滅高組IL-6、IL-8低于胃三聯(lián)組 （P＞0.05）。

3 討 論

中醫(yī)學認為脾主運化水谷精微，為津液代謝的樞紐，脾胃運化水液功能失司，易致濕濁內(nèi)生，濕聚日久化熱，是脾胃濕熱證的基本病機之一。而Hp是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，具有極強的運動能力。強動力性是Hp致病的重要因素。現(xiàn)代中醫(yī)通過臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)Hp和脾胃濕熱證在慢性胃炎的發(fā)生中起相輔相成的作用，Hp感染和脾胃濕熱證之間密切相關，Hp陽性的慢性胃炎患者中以脾胃濕熱證為最多［12］。有研究［13］認為慢性胃炎脾胃濕熱證 Hp感染率高，Hp可損害胃黏膜屏障，濕熱之邪與Hp在病因?qū)W上是同一致病原，Hp具有類似濕熱病邪的致病特點（隱匿性、漸進性、反復性、遷延性），胃內(nèi)“濕熱”環(huán)境有利于Hp的生存。

表1 各組小鼠胃黏膜組織AQP4、血清IL-6、IL-8表達水平比較（）

表1 各組小鼠胃黏膜組織AQP4、血清IL-6、IL-8表達水平比較（）

與正常對照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與滅高組比較，#P＜0.05。

AQP是一種位于細胞膜上的高度保守的疏水性跨膜小分子整合蛋白，具有滲透量調(diào)節(jié)、運輸生物前體、代謝廢物等生理功能［14］。IL-6、IL-8等細胞因子在介導和調(diào)節(jié)免疫應答及炎癥反應過程中起到重要作用，具有參與細胞免疫、炎癥反應等過程，對炎癥的發(fā)展起促進的作用。近年來發(fā)現(xiàn)AQP在機體水液轉(zhuǎn)運和代謝中起重要作用，對維持機體內(nèi)水平衡具有重要意義，是維持體內(nèi)水液代謝平衡的分子學基礎，為研究濕病的形成與防治提供了新思路［15］。有研究［16］從 AQP4表達變化探討了脾胃濕熱證的發(fā)生機理，并證明AQP4的異常表達是脾胃濕熱證的發(fā)生機制之一。陳更新等［17-18］研究亦認為AQP3、AQP4的異常表達與脾胃濕熱證的發(fā)生密切相關，并運用清熱化濕方調(diào)節(jié)AQP3、AQP4的表達發(fā)揮治療作用，治療慢性胃炎脾胃濕熱證。

本研究表明在濕熱環(huán)境和Hp等雙重因素的刺激下，可增加AQP4的釋放，刺激炎癥因子IL-6、IL-8的表達；給予清熱祛濕的中藥湯劑滅幽湯AQP4、IL-6、IL-8的表達明顯降低，說明滅幽湯可能通過調(diào)節(jié)AQP4、IL-6、IL-8的表達，減輕了胃黏膜的充血水腫等炎癥反應，從而達到治療Hp相關性脾胃濕熱型慢性胃炎的目的。

［1］Heyl KA，F(xiàn)ischer A，Gobel UB，et al.Inhibition of Helicobacter pylori urease activity in vivo by the synthetic nickel bind-ing protein Hpn［J］.Eur J Microbiol Immunoi，2013，3（1）：77-80.

［2］Diesing AK，Nossol C，F(xiàn)aber-Zuschratter H，et al.Rapid interaction of helicobacter pylori with microvilli of the polar human gastric epithelial cell line NCI-N87［J］.Anat Rec，2013，296（12）：1800-1805.

［3］Bodis B，Nagy G，Nemeth P，et al.Active water selective channels in the stomach：investigation of aquaporins after ethanol and capsaicin treatment in rats［J］.J Physiol Paris，2001，95（1）：271-275.

［4］王小娟，郭建生，李倩，等.滅幽湯對慢性胃炎幽門螺桿菌定植的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（1）：63-64.

［5］王小娟，郭建生，李倩，等.滅幽湯對濕熱型幽門螺桿菌相關性胃炎的療效分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2008，14（1）：67-68.

［6］王小娟，施花錦，郭建生，等.滅幽湯對小鼠幽門螺旋桿菌感染性胃炎NF-κB表達的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（3）：12-13.

［7］郭璇，伍參榮，王小娟，等.滅幽湯對幽門螺桿菌相關性胃炎小鼠胃黏膜組織 NF-κB和 IκBα 表達的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（11）：27-28.

［8］施花錦，王小娟，伍參榮，等.滅幽湯對幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（11）：85-87.

［9］廖瑩峰，文小敏，任璽，等.王氏連樸飲對脾胃濕熱證大鼠胃黏膜細胞凋亡調(diào)控基因蛋白的影響［J］.新中醫(yī)，2012，44（9）：122-124.

［10］李合國，勞紹賢.清濁安中湯對慢性胃炎脾胃濕熱證大鼠模型環(huán)氧合酶-2的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（8）：166-169.

［11］張靜祎，周曾芬，楊志偉，等.建立幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠動物模型的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結合消化雜志，2005，13（3）：182-183.

［12］燕東，劉紹能，李理，等.慢性胃炎幽門螺桿菌及病理與中醫(yī)辨證之間的關系［J］.吉林中醫(yī)藥，2010，30（5）：403-405.

［13］慢性胃炎脾胃濕熱證與血清胃泌素及幽門螺桿菌感染的相關性［J］.世界華人消化雜志，2010，18（8）：845-847.

［14］Almasalmeh A，Krenc D，Wu B，et al.Structural determinants of hydrogen peroxide permeability of aquaporins［J］.FEBS J，2013，11（2）：1121-1127.

［15］程波，蔣靜.水通道蛋白亞型AQP1的研究進展［J］.實用醫(yī)學雜志，2008，24（2）：317-318.

［16］李合國，李素娟，高軍麗.慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證與水通道蛋白及線粒體相關性研究［J］.新中醫(yī)，2012，44（5）：33-35.

［17］陳更新，勞紹賢，胡玲.清熱化濕方對脾胃濕熱證患者胃黏膜 AQP3、AQP4 蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)雜志，2005，46（10）：772.

［18］Wu xuan MEI，Shao xian LAO，Na YU，et al.Relationship between gene expressions of aquaporin 3 and 4 and various degress of spleen-stomach dampness-heat syndrome in chronic superficial gastritis［J］.Journal of Chinese Integrative Medicine，2010，8（2）：111-115.