人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對百草枯中毒肺損傷小鼠模型的治療作用

呂雙紅 ，王慧娜，杜麗欣，宋亞昆，吳東穎，劉兵，邱澤武

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院 a.腫瘤學(xué)研究室；b.307-青藤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心；c.中毒救治科；北京 100071

百草枯（paraquat，PQ）是一種廣泛使用的高效除草劑,對人有較強(qiáng)的毒性作用。由于其中毒致死量小、無特效解毒劑、常規(guī)對癥治療效果極差，故死亡率居高不下。百草枯中毒的特征性改變是肺損傷，早期表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞受損，肺泡內(nèi)出血水腫，晚期則表現(xiàn)為肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化。

近年來，隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，干細(xì)胞在臨床難治性和頑固性疾病治療方面的應(yīng)用研究越來越多。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）因取材方便、再生能力強(qiáng)、細(xì)胞增殖快、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)而廣受青睞。已有研究[1]顯示，MSC可被募集到肺損傷部位，分化并修復(fù)肺泡上皮細(xì)胞，增加表面活性物質(zhì)分泌，減輕炎癥反應(yīng)，具有治療肺損傷的巨大潛力。在本研究中，我們探討了臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord MSC，UCMSC）治療百草枯中毒性肺損傷的可行性，旨在為百草枯中毒的臨床治療開拓新的途徑。

1 材料與方法

1.1 UCMSC的分離、培養(yǎng)、鑒定

UCMSC 取自空軍總醫(yī)院健康剖腹產(chǎn)胎兒，經(jīng)知情同意，無感染性疾病。將臍帶樣品沖洗干凈，剪成2～3 mm3的小塊，加入1%膠原酶消化液于37℃消化2 h，用70 μm 篩網(wǎng)過濾，收集上清，離心收集細(xì)胞；用PBS 清洗后，加入5 mL 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%～90%匯合時，按1∶2或1∶3 的比例傳代。動物體內(nèi)移植采用6～8 代細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測MSC表面標(biāo)志的表達(dá)。

1.2 百草枯中毒性肺損傷模型的制備

健康成年雄性C57BL/6 小鼠（8 周齡，20～22 g）購自北京華阜康生物科技公司，在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，于屏障環(huán)境內(nèi)活動，室內(nèi)恒溫恒濕，人工照明12 h/d，自由進(jìn)食、水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后一次性腹腔注射百草枯溶液，注射液體量為0.2 mL/10 g。急性肺損傷動物模型于造模后7 d處死，肺纖維化模型于造模后21 d處死。

1.3 動物分組

105 只小鼠，根據(jù)百草枯給藥劑量（40、50、60 mg/kg）及是否輸注UCMSC 進(jìn)行治療分為6 組：40 mg/kg-PBS 組（n=30）；40 mg/kg-UCMSC 組（n=29）；50 mg/kg-PBS 組（n=13）；50 mg/kg-UCMSC 組（n=13）；60 mg/kg-PBS 組（n=10）；60 mg/kg-UCMSC 組（n=10）。PBS 組于百草枯造模后24 h 尾靜脈注射PBS；UCMSC 組于造模后24 h 尾靜脈輸注UCMSC。其中40 mg/kg-PBS 組和40 mg/kg-UCMSC 組各取14 只于21 d 處死，觀察UCMSC 對百草枯誘導(dǎo)肺纖維化的治療作用；其余動物于7 d處死，觀察UCMSC對急性肺損傷的治療作用。記錄死亡率和體重變化，并取肺組織進(jìn)行病理包埋和切片，病理評分。

1.4 肺組織病理切片染色及評分

肺組織切片經(jīng)常規(guī)HE染色，按急性肺損傷或肺纖維化評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。急性肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]，病理評分范圍為0～16 分。肺纖維化評分標(biāo)準(zhǔn)采用Ashcroft 的方法[3]。若每一視野內(nèi)正常組織結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)（＞50%），則予評0 分；若每一顯微視野內(nèi)肺纖維化病變占主導(dǎo)（＞50%），則其具體分級標(biāo)準(zhǔn)如表1。若評分級別在2個奇數(shù)得分之間時，則取其中間值。

1.5 PCR檢測UCMSC植入

8 只40 mg/kg 百草枯染毒動物，分別于UCMSC移植后3 h、24 h、7 d 取肺組織，提取基因組DNA，RT-PCR 檢測人特異性線粒體基因chrome B mitochondria（CBM）的表達(dá)情況。所用引物為Forward（5'CATGGTGAAACCCCGTCTCTA3'）和Reverse（5'GCCTCAGCCTCCCGAGTAG3'）。擴(kuò)增條件：94℃5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，30個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UCMSC 移植對百草枯中毒性急性肺損傷的治療作用

動物給予不同劑量百草枯腹腔注射造模，24 h后尾靜脈輸注UCMSC 治療。結(jié)果顯示，UCMSC 治療可提高較低劑量（40、50 mg/kg）百草枯中毒動物的生存率，劑量過高（60 mg/kg）時UCMSC 對動物的生存率并沒有改善，表明過高的百草枯引起的肺損傷過程可能已處于不可逆的狀態(tài)。但肺組織病理評分沒有統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是由于病理的改變需要一定的時間。

2.2 UCMSC 對百草枯中毒誘導(dǎo)的肺纖維化的治療作用

腹腔注射40 mg/kg 百草枯溶液后小鼠體重明顯下降，到第5 d 下降到最低值，隨后緩慢恢復(fù)，但UCMSC 尾靜脈注射治療組動物的體重恢復(fù)較早較快。生存率曲線顯示，UCMSC 治療后動物的生存率提高（圖2）。

表1 肺組織纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)

表2 UCMSC對急性百草枯中毒小鼠死亡率的影響

表3 小鼠急性肺損傷病理評分

百草枯染毒后21 d 肺組織有充血及出血，肺泡壁增厚，部分閉塞，血管及支氣管周圍可見纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積，嚴(yán)重時可觀察到肺結(jié)構(gòu)明顯破壞，纖維塊或纖維束形成。UCMSC 治療組肺組織纖維化程度減輕（圖3），Ashcroft 病理評分顯著降低（表4）。這些結(jié)果表明，UCMSC 治療百草枯中毒誘導(dǎo)的纖維化可取得一定的療效。

2.3 PCR檢測UCMSC植入結(jié)果

RT-PCR 結(jié)果顯示，在UCMSC 移植后3 h 的肺組織中有人特異性CBM基因表達(dá)，但24 h后未檢測到，表明移植細(xì)胞在肺內(nèi)可能無植入。

3 討論

圖1 小鼠急性百草枯中毒性肺損傷HE染色

圖2 UCMSC對小鼠百草枯中毒性肺纖維化的治療作用

表4 UCMSC治療百草枯誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的死亡率及病理評分

百草枯是一種有較強(qiáng)毒性的除草劑，由于肺部細(xì)胞對其有主動攝取和蓄積作用，使得肺受損最為嚴(yán)重，臨床尚無特效解毒藥物，因此患者病死率極高。血液灌流是當(dāng)前治療百草枯中毒的有效方法，但其對百草枯所造成的肺損傷臨床療效極為有限。

MSC 最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注。研究證實(shí)[1]，UCMSC 移植后能夠植入損傷肺部，進(jìn)一步分化為肺上皮細(xì)胞，并通過減少促炎癥細(xì)胞因子、升高抗炎癥細(xì)胞因子、減輕肺水腫等途徑，對肺損傷起到一定的治療作用。研究表明[4]，與MSC 共培養(yǎng)可減少肺Ⅱ型上皮細(xì)胞對百草枯的蓄積量，上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，有利于上皮細(xì)胞的存活。將骨髓MSC 植入百草枯染毒大鼠后，減輕了模型動物的肺損傷[5-7]。但骨髓源MSC 受患者年齡、體質(zhì)等因素的限制，且具有創(chuàng)傷性；而UCMSC 來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無倫理道德問題的限制，且細(xì)胞增殖、分化能力較強(qiáng)，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)，因此，已成為骨髓MSC 的理想替代來源。但UCMSC 用于百草枯中毒性肺損傷的研究僅有個別報道。

已有動物實(shí)驗(yàn)研究[8]表明UCMSC 對脂多糖（LPS）引起的急性肺損傷具有治療作用。國內(nèi)也有臨床應(yīng)用UCMSC 治療百草枯中毒病例的報道[9]，發(fā)現(xiàn)治療后病人死亡率降低。但目前尚無UCMSC 治療百草枯肺損傷的動物實(shí)驗(yàn)研究，也沒有證據(jù)表明UCMSC 治療百草枯肺損傷有明確療效。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，采用UCMCS 治療百草枯中毒性急性肺損傷，在較低劑量百草枯中毒模型中可提高動物的生存率，但百草枯劑量過高時UCMSC 對動物生存率并沒有改善，表明過高的百草枯引起的肺損傷過程已處于不可逆狀態(tài)。低劑量百草枯中毒模型中UCMSC 雖能改善生存率，肺組織病理評分仍沒有統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是由于病理的改變需要一定的時間。有鑒于此，臨床應(yīng)用UCMSC 治療急性百草枯中毒時，需要選擇合適的病例。

圖3 UCMSC治療小鼠百草枯中毒性肺纖維化HE染色

圖4 人特異性CBM基因的RT-PCR檢測結(jié)果

Yamashita[10]對存活的百草枯中毒患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，即使是輕微的肺損傷，仍可引起患者在較長時間內(nèi)的限制性肺功能損傷，最終導(dǎo)致不可逆的肺間質(zhì)纖維化，而一旦出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化，病人預(yù)后極差，目前尚無確切有效的救治手段。Moodley 等[11]的研究表明，UCMSC 可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。另有研究[12]表明，骨髓MSC 可減輕百草枯中毒大鼠肺纖維化的程度。本研究證實(shí)，UCMSC 對百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化有較好的治療作用，動物體重恢復(fù)較早，存活率提高，肺纖維化評分顯著降低。這一結(jié)果為未來使用UCMSC 治療臨床百草枯中毒病人的肺纖維化提供了理論依據(jù)。

目前認(rèn)為，MSC 發(fā)揮治療作用的主要機(jī)理是其旁分泌作用[13]。因?yàn)樵诤芏嘁浦惭芯恐卸及l(fā)現(xiàn)，即使MSC 治療有效，在移植部位也只能檢測到很少或甚至不能檢測到移植細(xì)胞。越來越多的研究表明，各種來源的MSC 均可分泌多種生物活性因子，以旁分泌的方式對靶細(xì)胞發(fā)揮抗疤痕形成、抗炎、抗凋亡等作用。本研究中，我們在移植后3 h 的肺組織中可檢測到人特異性基因，但24 h 后未檢測到，這表明UCMSC起作用的方式可能也是通過旁分泌途徑。

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