• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人乳頭瘤病毒18型L1蛋白的包涵體和可溶性表達及純化

    2014-11-29 08:31:28麻粉蓮張騫鄭麗舒
    生物技術(shù)通訊 2014年6期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性菌體條帶

    麻粉蓮,張騫,鄭麗舒

    中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所,北京 100052

    人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)與人類多種疾病的發(fā)生有關(guān),宮頸癌與HPV 感染密切相關(guān)。HPV L1 蛋白能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒,具有與完整病毒相同的抗原空間表位,免疫后可產(chǎn)生高滴度的中和抗體。因此,L1蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。我們采用GST標(biāo)記的原核表達系統(tǒng),構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1,HPV L1融合蛋白在大腸桿菌BL21 中以包涵體和可溶性形式高效表達,并建立了蛋白純化方法,獲得了HPV18 L1蛋白,為研究HPV疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態(tài)購于博邁德生物有限公司;pGEX-4T-1和pMD18-T載體均由本實驗室保存。凝血酶、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購自GE 公司;蛋白marker、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司;尿素、DTT、Tris、IPTG、氧化型和還原型谷胱甘肽購自Promega公司。

    1.2 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

    根據(jù)GenBank中HPV18 L1(NC_001357.1)序列和大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 序列,在5′和3′端分別引入限制性酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ,送Invitrogen 公司合成。將L1 序列連接至pMD18-T 載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,測序鑒定。

    1.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1的構(gòu)建

    用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD18-THPV18 L1,用T4DNA 連接酶連接于經(jīng)同樣酶切的表達質(zhì)粒pGEX-4T-1上,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑選陽性菌落,提取質(zhì)粒,雙酶切和PCR鑒定。

    1.4 HPV18 L1蛋白的表達

    將鑒定正確的陽性克隆接種于含氨芐西林(l00 μg/mL)的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后,按1∶50 的比例轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)液中,當(dāng)菌液D600nm值達0.6 時加入IPTG 于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h(IPTG 終濃度為0.2 mmol/L)或于16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h(IPTG 終濃度為0.1 mmol/L),4℃、5000 r/min 離心10 min 收集菌體,重懸于PBS,超聲破碎細菌,離心收集上清和沉淀,12% SDS-PAGE鑒定并分析目的蛋白的表達。

    1.5 HPV18 L1蛋白的純化

    1.5.1 包涵體純化 經(jīng)12% SDS-PAGE 鑒定,37℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為包涵體形式,在破碎菌體的沉淀內(nèi)有大量目的蛋白。大量表達HPV18 L1蛋白,收集菌體,PBS 洗滌,加入菌體超聲波裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl,0.1 mmol/L EDTA,0.5 mol/L NaCl,0.1% TrixtonX-100,pH8.0)破碎菌體,4℃、5000 r/min 離心25 min,棄上清,收集沉淀;沉淀中加入包涵體洗滌液Ⅰ(50 mmol/L Tris-Cl,5 mmol/L EDTA,2 mol/L 尿素,0.5% Triton X-100,pH8.0)洗滌,4℃、12 000 r/min 離心30 min,收集沉淀;沉淀中加入包涵體洗液Ⅱ(50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0)洗滌,離心后用雙蒸水洗滌沉淀,離心收集沉淀;用包涵體裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,2 mol/L 尿素,pH12.0)溶解沉淀,將變性的包涵體裝入透析袋,用復(fù)性液Ⅰ(50 mmol/L Tris-Cl,0.1 mmol/L DTT,pH8.0)于4℃透析12 h,50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)于4℃透析12 h,復(fù)性液Ⅱ(50 mmol/L Tris-Cl,0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽,1 mmol/L 還原型谷胱甘肽,pH8.0)于4℃透析12 h;透析結(jié)束,4℃、12 000 r/min 離心30 min,收集上清和沉淀;包涵體復(fù)性產(chǎn)物用0.45 μm 濾器過濾,用GST 4B 純化試劑盒純化;用PBS 平衡GST 柱子后將復(fù)性產(chǎn)物上樣,充分洗去雜蛋白,用還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白,收集不同峰值樣品,經(jīng)12% SDS-PAGE和Western印跡鑒定。

    1.5.2 可溶性L1 蛋白的純化 經(jīng)12% SDS-PAGE鑒定,16℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為可溶性表達,在破碎菌體的上清和沉淀內(nèi)均有目的蛋白。大量表達HPV18 L1 蛋白,超聲波破碎菌體,收集上清,進行GST 4B親和純化。為去除分子伴侶,在破碎菌體中加入1 mmol/L ATP 孵育30 min,再加入3.5 mol/L尿素孵育30 min,4℃、14 400 r/min 離心75 min,收集上清,進行GST 4B親和純化。收集不同峰值的樣品,經(jīng)超濾管濃縮后,用50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)于4℃透析18 h。每毫升蛋白加入20 U 凝血酶,22℃孵育8 h,用Western印跡鑒定酶切結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

    HPV18 L1 基因全長1602 bp,編碼533 個氨基酸殘基。按照大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 基因序列后,密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)由0.228 上升為0.578,密碼子偏愛指數(shù)(CBI)由-0.09 上升為0.470,氨基酸序列未發(fā)生改變。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pMD18-T-L1的序列正確。

    2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 的雙酶切和PCR鑒定

    用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1,同時進行PCR 鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在1600 bp 處均有目的條帶(圖1),表明L1基因成功插入pGEX-4T-1載體。

    2.3 HPV18 L1蛋白原核表達的鑒定

    經(jīng)12% SDS-PAGE 檢測,在37℃用0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達4 h,L1 蛋白以包涵體形式存在,在相對分子質(zhì)量約86 000 處可見明顯條帶(圖2),與HPV18 L1-GST融合蛋白預(yù)期大小吻合。在16℃用0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h,L1 蛋白為可溶性表達,在破碎菌體的上清和沉淀中均有相對分子質(zhì)量約86 000的新增條帶,上清孔中約60 000的條帶為分子伴侶GroEL(圖3)。

    2.4 包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

    12% SDS-PAGE 結(jié)果表明,包涵體經(jīng)洗滌后雜蛋白減少,目的蛋白含量較高。經(jīng)堿變性溶解包涵體,大量菌體被溶解。蛋白復(fù)性后用GST 4B進行親和純化,在相對分子質(zhì)量約86 000 處有單一條帶,為HPV18L1-GST融合蛋白(圖4)。

    2.5 可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

    將破碎的菌體上清進行GST 4B親和純化,發(fā)現(xiàn)GroEL 和HPV18L1-GST 融合蛋白共同被純化,相對分子質(zhì)量分別為60 000 和86 000。但是,如果在超聲波破碎的菌體中加入ATP 和尿素作用后,經(jīng)GST 4B 親和層析純化可得到HPV18 L1-GST 融合蛋白,同時可去除GroEL(圖5)。

    圖1 重組質(zhì)粒的PCR(A)和酶切(B)鑒定

    圖2 HPV18 L1表達的SDS-PAGE分析

    圖3 HPV18 L1不同表達方式的SDS-PAGE分析

    圖4 以包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

    2.6 HPV18 L1-GST融合蛋白的Western印跡鑒定

    包涵體形式表達的HPV18 L1-GST融合蛋白純化后降解條帶較多,而可溶性表達的融合蛋白純化后條帶單一,無蛋白降解現(xiàn)象(圖6)。

    2.7 HPV18 L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

    可溶性表達的蛋白純化后得到的HPV18 L1-GST 融合蛋白條帶單一,經(jīng)凝血酶酶切后可去除GST 標(biāo)簽,Western 印跡檢測顯示在相對分子質(zhì)量60 000 處有明顯條帶,能被HPV18 L1 特異性抗體識別,為HPV18 L1蛋白,相對分子質(zhì)量42 000處的條帶為L1蛋白的降解產(chǎn)物(圖7)。

    3 討論

    圖5 以可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

    圖6 HPV18L1-GST融合蛋白的Western印跡

    圖7 HPV18L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

    外源基因在大腸桿菌中的高效表達受很多因素的影響。用pUC 表達載體表達HPV18 L1 蛋白時,目的蛋白發(fā)生降解,表達量低。本實驗采用了帶有GST 標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-1,GST 既能增加外源蛋白的可溶性,提高蛋白質(zhì)的表達量,又便于親合層析純化目的蛋白。本實驗構(gòu)建了pGEX-4T-1-HPV18 L1 重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)后HPV18 L1 以GST 融合蛋白的形式表達,SDS-PAGE 可見相對分子質(zhì)量86 000 條帶。37℃以0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達4 h,蛋白為包涵體形式,經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性和GST 4B 親和純化,可獲得HPV18 L1-GST 融合蛋白,但降解條帶較多。16℃以0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h,蛋白為可溶性形式,經(jīng)去除分子伴侶GroEL、GST 4B親和純化和凝血酶酶切去除GST標(biāo)簽,可獲得HPV18 L1純化蛋白,但酶切效率有待提高。

    尿素、鹽酸胍變性會破環(huán)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),使疏水性氨基酸殘基暴露在表面。包涵體溶解與尿素濃度、蛋白質(zhì)濃度和溶液pH 值有關(guān)。本實驗中,將包涵體在堿變性條件下溶解,將可溶部分用含有還原劑的中性緩沖液透析促進二硫鍵正確折疊,多余的還原劑可再次透析除去,大部分包涵體在50 mmol/L Tris(pH12.0)和2 mol/L 尿素中可以溶解。此方法既能保持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),又使蛋白質(zhì)溶解達到最大化[1]。在復(fù)性過程中,有許多條件影響目的蛋白的重折疊。一是細菌成分和雜蛋白的影響。低濃度尿素、TritonX-100 和EDTA 有利于除去脂類、脂多糖、核酸等雜質(zhì)。其次,復(fù)性時蛋白質(zhì)濃度很關(guān)鍵,蛋白質(zhì)濃度高于1 mg/mL,則復(fù)性得率低于10%,蛋白質(zhì)濃度為10~50 μg/mL時復(fù)性得率最高。三是小分子添加劑的使用。L1 蛋白含有12 個半胱氨酸殘基,為高度富含二硫鍵的蛋白質(zhì),DTT、氧化型和還原型谷胱甘肽能夠促進L1蛋白的正確折疊。

    將可溶性HPV18 L1 蛋白進行GST 4B 親和層析純化,同時得到分子伴侶GroEL 和HPV18L1-GST融合蛋白,這與Chen 的報道一致[2]。在蛋白質(zhì)折疊過程中,GroEL 結(jié)合伸展的肽鏈或折疊的中間態(tài),并在ATP 和GroES 的作用下,水解ATP 釋放底物蛋白質(zhì)和能量,促進底物蛋白質(zhì)的折疊。GroEL 可通過不同的作用力與各種底物結(jié)合,利用層析技術(shù)也不能使其分開,說明兩者之間存在相互作用。去除與底物多肽緊密結(jié)合的GroEL 有三種方法:一是通過ATP 和大腸桿菌變性蛋白質(zhì)的作用可以有效去除GroEL[3],但考慮到大腸桿菌變性蛋白中雜帶較多,我們未采取此方法。二是改變GroEL 的基因片段,使后期純化時無GroEL 存在[4]。三是ATP 和尿素共同作用去除GroEL。GroEL 具有ATP 激酶活性[5]。ATP 水解是誘導(dǎo)GroEL 構(gòu)象變化的關(guān)鍵,在ATP 的作用下,分子伴侶與目的蛋白之間從緊密結(jié)合變成疏松結(jié)合狀態(tài)。3.5 mol/L尿素可以打亂GroEL二級結(jié)構(gòu)[6]。ATP 結(jié)合GroEL 后,尿素能進一步誘導(dǎo)GroEL 和底物蛋白質(zhì)解聚,將目的蛋白從GroEL 上釋放出來,本研究即采用此法。

    大腸桿菌表達系統(tǒng)是表達外源蛋白質(zhì)的首選系統(tǒng)。若大腸桿菌中表達的蛋白折疊成對熱不穩(wěn)定的中間體,便會促進包涵體形成。低溫表達可降低翻譯速率,使蛋白質(zhì)有足夠時間正確折疊,并能減少重組蛋白的熱變性,因此,低溫培養(yǎng)條件能在一定程度上抑制包涵體的形成。雖然低溫表達時延長了外源蛋白誘導(dǎo)時間,但相對于其后包涵體變性、復(fù)性等步驟的繁瑣,目的蛋白含量的損失和天然活性的喪失,本實驗選擇低溫表達HPV18 L1 蛋白是可行的。本研究建立了HPV18 L1 融合蛋白的純化方法,酶切去除了GST 標(biāo)簽,獲得了HPV18 L1 蛋白,是后續(xù)疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。

    [1]Khan R H,Rao K B C,Eshwari A N S,et al.Solubilization of recombinant ovine growth hormone with retention of nativelike secondary structure and its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli[J].Biotechnol Prog,1998,14(5):722-728.

    [2]Chen X S,Gregory C,Stephen C H,et al.Papillomavirus capsid protein expression in Escherichia coli:purification and assembly of HPV11 and HPV16 L1[J].J Mol Biol,2001,307(1):173-182.

    [3]Mattias R,Kimberly J H.Separation of copurifying Groel from glutathione-S-transferase fusion proteins[J].Protein Expr Purif,2000,20(1):45-47.

    [4]Masayuki F,Lawrence S.Recombinant expression and purification of smad proteins[J].Protein Expr Purif,2000,20(3):507-513.

    [5]Amnon H.Structural aspects of Groel function[J].Curr Opin Struct Biol,1998,8(1):93-100.

    [6]Andreas B,Brian P S,Hanno E,et al.Isolation and biochemical characterization of highly purified escherichia coli molecular chaperone Cpn60(groel) by affinity chromatography and urea-induced monomerization[J].BBA Protein Struct Mol Enzymol,1995,1252(1):69-78.

    猜你喜歡
    復(fù)性菌體條帶
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    籽骨嵌頓致難復(fù)性[足母]趾趾間關(guān)節(jié)脫位的治療
    《復(fù)性書》性情觀再探——以“情”為中心的考察
    中藥坐浴方聯(lián)合激光燒灼療法治療易復(fù)性肛周尖銳濕疣術(shù)后47例
    一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動拼接算法
    海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
    日韩亚洲欧美综合| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲精品av在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久精品人妻少妇| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品亚洲一区二区| 草草在线视频免费看| 十八禁网站免费在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 老鸭窝网址在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一个人免费在线观看电影| 久久精品综合一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 青草久久国产| 一级av片app| 又爽又黄无遮挡网站| 久久伊人香网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产色婷婷99| 成年版毛片免费区| 午夜福利在线在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 长腿黑丝高跟| 亚洲国产欧美人成| 久久国产乱子伦精品免费另类| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产三级在线视频| 久久久成人免费电影| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美日韩东京热| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产成年人精品一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩欧美三级三区| 日本在线视频免费播放| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 宅男免费午夜| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 久久久久久久久久成人| 一区福利在线观看| 久久久久九九精品影院| 在线观看免费视频日本深夜| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 免费看a级黄色片| 欧美在线黄色| 午夜两性在线视频| 免费看光身美女| 日本五十路高清| 精品久久久久久,| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品久久久久久成人av| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜两性在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 动漫黄色视频在线观看| 在现免费观看毛片| 1024手机看黄色片| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产午夜精品论理片| 黄色丝袜av网址大全| 免费黄网站久久成人精品 | 精品日产1卡2卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线免费观看不下载黄p国产 | 舔av片在线| 舔av片在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲自偷自拍三级| 天堂√8在线中文| 亚洲熟妇熟女久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美精品啪啪一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99热这里只有是精品在线观看 | 精品久久久久久成人av| 最新在线观看一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 午夜老司机福利剧场| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人福利小说| 黄片小视频在线播放| 亚洲av.av天堂| 亚洲av.av天堂| 国产91精品成人一区二区三区| 草草在线视频免费看| 国产一区二区在线观看日韩| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品影院久久| 午夜福利高清视频| 动漫黄色视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 色5月婷婷丁香| 国产熟女xx| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产野战对白在线观看| av天堂在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 麻豆成人av在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费黄网站久久成人精品 | 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲黑人精品在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费看a级黄色片| 全区人妻精品视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 最近最新中文字幕大全电影3| www.熟女人妻精品国产| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av美国av| 国产三级在线视频| 精品国产亚洲在线| 精品人妻视频免费看| 三级毛片av免费| 在线观看66精品国产| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99在线视频只有这里精品首页| 久久草成人影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 直男gayav资源| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲经典国产精华液单 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品久久久久久久末码| 国产中年淑女户外野战色| 国产综合懂色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久国产精品影院| 日韩欧美精品v在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产不卡一卡二| 精品久久久久久久久亚洲 | 成人永久免费在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 日韩欧美在线二视频| 成年免费大片在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产 一区 欧美 日韩| 免费在线观看日本一区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 天堂网av新在线| 9191精品国产免费久久| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 精品人妻1区二区| www日本黄色视频网| 在线观看一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲美女视频黄频| 免费电影在线观看免费观看| 深夜精品福利| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 90打野战视频偷拍视频| 听说在线观看完整版免费高清| av视频在线观看入口| 一边摸一边抽搐一进一小说| 熟女人妻精品中文字幕| 国产单亲对白刺激| 黄色丝袜av网址大全| 免费人成在线观看视频色| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 91在线观看av| 亚洲经典国产精华液单 | 国产精华一区二区三区| 亚洲国产色片| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 乱码一卡2卡4卡精品| 91狼人影院| 日韩精品中文字幕看吧| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久成人免费电影| 久久久精品欧美日韩精品| 老鸭窝网址在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 色av中文字幕| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩国产亚洲二区| 动漫黄色视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av成人av| 舔av片在线| 老女人水多毛片| 成人特级av手机在线观看| 久久久久久大精品| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲第一电影网av| 在线观看舔阴道视频| 久久精品91蜜桃| 精品久久久久久,| 亚洲激情在线av| 一级毛片久久久久久久久女| 禁无遮挡网站| 精品久久久久久成人av| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产黄色小视频在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲电影在线观看av| 男人舔奶头视频| 国产高清激情床上av| 国产三级黄色录像| 日本 欧美在线| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 激情在线观看视频在线高清| 午夜福利高清视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲18禁久久av| 丰满乱子伦码专区| 国产精华一区二区三区| 免费看日本二区| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品不卡国产一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 他把我摸到了高潮在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国语自产精品视频在线第100页| 日韩精品青青久久久久久| 草草在线视频免费看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久久九九精品影院| 成年免费大片在线观看| 免费av观看视频| 日韩欧美精品v在线| av视频在线观看入口| 亚洲精品456在线播放app | 日韩精品中文字幕看吧| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 色综合站精品国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产探花在线观看一区二区| 国产高潮美女av| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲18禁久久av| 熟女人妻精品中文字幕| 午夜视频国产福利| 波多野结衣高清无吗| 国产91精品成人一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 两人在一起打扑克的视频| 91狼人影院| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人特级av手机在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品影院久久| 一级毛片久久久久久久久女| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 婷婷色综合大香蕉| 69av精品久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 免费看a级黄色片| 成人午夜高清在线视频| 直男gayav资源| 午夜两性在线视频| 波多野结衣高清作品| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美潮喷喷水| 日本与韩国留学比较| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产高清三级在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品三级大全| 午夜激情欧美在线| 国产精品99久久久久久久久| 91av网一区二区| 欧美成人a在线观看| 99久国产av精品| 九九在线视频观看精品| 国产成人福利小说| x7x7x7水蜜桃| 午夜福利18| 黄色视频,在线免费观看| 极品教师在线视频| 99久久九九国产精品国产免费| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲五月天丁香| 怎么达到女性高潮| 男人舔奶头视频| 有码 亚洲区| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜日韩欧美国产| 精华霜和精华液先用哪个| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费观看精品视频网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 露出奶头的视频| 亚洲av不卡在线观看| 免费av不卡在线播放| 88av欧美| 热99re8久久精品国产| 91狼人影院| 日本 av在线| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕高清在线视频| 国产野战对白在线观看| 69人妻影院| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品福利观看| 我的女老师完整版在线观看| 毛片女人毛片| 9191精品国产免费久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 97碰自拍视频| 淫秽高清视频在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 两个人的视频大全免费| 久久久久久久午夜电影| 国内精品久久久久久久电影| 欧美精品啪啪一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 国产美女午夜福利| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产高清激情床上av| 日韩有码中文字幕| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一进一出好大好爽视频| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产色片| 搡老熟女国产l中国老女人| 99久久精品热视频| 简卡轻食公司| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产精品久久久久久久久免 | 长腿黑丝高跟| 国产日本99.免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费搜索国产男女视频| 欧美3d第一页| .国产精品久久| 五月伊人婷婷丁香| 欧美一区二区亚洲| 久久草成人影院| 一级黄色大片毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄色一级大片看看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费在线观看成人毛片| 看十八女毛片水多多多| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产av在哪里看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人欧美在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 深夜精品福利| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜两性在线视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲男人的天堂狠狠| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久精品国产欧美久久久| 身体一侧抽搐| 国产av麻豆久久久久久久| 小说图片视频综合网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 高清在线国产一区| 身体一侧抽搐| 欧美成人性av电影在线观看| 99久国产av精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 夜夜爽天天搞| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日韩中字成人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产毛片a区久久久久| 深夜精品福利| 99热这里只有精品一区| 日韩精品青青久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 久久中文看片网| 最新在线观看一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 观看免费一级毛片| www日本黄色视频网| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久久久久大av| 性欧美人与动物交配| 成人特级黄色片久久久久久久| 一级毛片久久久久久久久女| 天堂网av新在线| www.色视频.com| 久久久久性生活片| 久久香蕉精品热| 男女之事视频高清在线观看| 窝窝影院91人妻| 久久中文看片网| 如何舔出高潮| 老熟妇仑乱视频hdxx| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲最大成人手机在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产免费av片在线观看野外av| 日本一二三区视频观看| 成人国产综合亚洲| 九色成人免费人妻av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜免费成人在线视频| 麻豆国产av国片精品| 麻豆成人av在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| av中文乱码字幕在线| 精品久久久久久久末码| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩欧美在线二视频| 好男人电影高清在线观看| h日本视频在线播放| 12—13女人毛片做爰片一| 日本免费a在线| aaaaa片日本免费| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av成人av| 性欧美人与动物交配| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美在线一区亚洲| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美bdsm另类| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 色哟哟·www| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| av天堂中文字幕网| 久久精品国产清高在天天线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99久久九九国产精品国产免费| 男女床上黄色一级片免费看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 免费搜索国产男女视频| a级一级毛片免费在线观看| 免费高清视频大片| 久久国产精品人妻蜜桃| av国产免费在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精华国产精华精| 免费看光身美女| 国产一区二区在线av高清观看| 天堂影院成人在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美黄色淫秽网站| 国产三级在线视频| 能在线免费观看的黄片| 婷婷精品国产亚洲av| 性色av乱码一区二区三区2| 中文资源天堂在线| 成人特级av手机在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一区二区三区免费毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 最近视频中文字幕2019在线8| 99精品在免费线老司机午夜| 一二三四社区在线视频社区8| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久99热这里只有精品18| 国产精品久久久久久久久免 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中文字幕av在线有码专区| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热这里只有精品一区| 一a级毛片在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 女人被狂操c到高潮| 村上凉子中文字幕在线| 精品无人区乱码1区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲成av人片免费观看| 999久久久精品免费观看国产| 男插女下体视频免费在线播放| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美在线一区亚洲| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 69人妻影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 在线观看美女被高潮喷水网站 | www日本黄色视频网| 国产成人欧美在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 97碰自拍视频| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久精品人妻少妇| 99热6这里只有精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产成人av教育| 一进一出抽搐gif免费好疼| 可以在线观看的亚洲视频| ponron亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 村上凉子中文字幕在线| 老司机福利观看| 免费av毛片视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线看三级毛片| 男人舔奶头视频| 国产69精品久久久久777片| 国产野战对白在线观看| 国产精品久久久久久久久免 | 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 性色avwww在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 一本一本综合久久| 日本黄大片高清| 能在线免费观看的黄片| 精品人妻1区二区| 老司机福利观看| 少妇丰满av| 久久伊人香网站| 亚洲激情在线av| 成人一区二区视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品女同一区二区软件 | 日韩精品中文字幕看吧| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品久久视频播放| 精品国产亚洲在线| 日韩有码中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品午夜福利视频在线观看一区| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品人妻视频免费看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一本精品99久久精品77| 亚洲av成人av| 亚洲成av人片在线播放无| 嫩草影院精品99| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 深爱激情五月婷婷| 激情在线观看视频在线高清| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 午夜福利免费观看在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩av在线大香蕉| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产成人aa在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲激情在线av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 又爽又黄无遮挡网站| 久久亚洲精品不卡| 精品久久久久久成人av| 少妇丰满av| www.熟女人妻精品国产| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品不卡视频一区二区 | 欧美日本视频| 亚洲av一区综合| 国产乱人伦免费视频|