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    人乳頭瘤病毒18型L1蛋白的包涵體和可溶性表達及純化

    2014-11-29 08:31:28麻粉蓮張騫鄭麗舒
    生物技術(shù)通訊 2014年6期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性菌體條帶

    麻粉蓮,張騫,鄭麗舒

    中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所,北京 100052

    人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)與人類多種疾病的發(fā)生有關(guān),宮頸癌與HPV 感染密切相關(guān)。HPV L1 蛋白能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒,具有與完整病毒相同的抗原空間表位,免疫后可產(chǎn)生高滴度的中和抗體。因此,L1蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。我們采用GST標(biāo)記的原核表達系統(tǒng),構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1,HPV L1融合蛋白在大腸桿菌BL21 中以包涵體和可溶性形式高效表達,并建立了蛋白純化方法,獲得了HPV18 L1蛋白,為研究HPV疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態(tài)購于博邁德生物有限公司;pGEX-4T-1和pMD18-T載體均由本實驗室保存。凝血酶、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購自GE 公司;蛋白marker、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司;尿素、DTT、Tris、IPTG、氧化型和還原型谷胱甘肽購自Promega公司。

    1.2 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

    根據(jù)GenBank中HPV18 L1(NC_001357.1)序列和大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 序列,在5′和3′端分別引入限制性酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ,送Invitrogen 公司合成。將L1 序列連接至pMD18-T 載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,測序鑒定。

    1.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1的構(gòu)建

    用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD18-THPV18 L1,用T4DNA 連接酶連接于經(jīng)同樣酶切的表達質(zhì)粒pGEX-4T-1上,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑選陽性菌落,提取質(zhì)粒,雙酶切和PCR鑒定。

    1.4 HPV18 L1蛋白的表達

    將鑒定正確的陽性克隆接種于含氨芐西林(l00 μg/mL)的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后,按1∶50 的比例轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)液中,當(dāng)菌液D600nm值達0.6 時加入IPTG 于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h(IPTG 終濃度為0.2 mmol/L)或于16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h(IPTG 終濃度為0.1 mmol/L),4℃、5000 r/min 離心10 min 收集菌體,重懸于PBS,超聲破碎細菌,離心收集上清和沉淀,12% SDS-PAGE鑒定并分析目的蛋白的表達。

    1.5 HPV18 L1蛋白的純化

    1.5.1 包涵體純化 經(jīng)12% SDS-PAGE 鑒定,37℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為包涵體形式,在破碎菌體的沉淀內(nèi)有大量目的蛋白。大量表達HPV18 L1蛋白,收集菌體,PBS 洗滌,加入菌體超聲波裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl,0.1 mmol/L EDTA,0.5 mol/L NaCl,0.1% TrixtonX-100,pH8.0)破碎菌體,4℃、5000 r/min 離心25 min,棄上清,收集沉淀;沉淀中加入包涵體洗滌液Ⅰ(50 mmol/L Tris-Cl,5 mmol/L EDTA,2 mol/L 尿素,0.5% Triton X-100,pH8.0)洗滌,4℃、12 000 r/min 離心30 min,收集沉淀;沉淀中加入包涵體洗液Ⅱ(50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0)洗滌,離心后用雙蒸水洗滌沉淀,離心收集沉淀;用包涵體裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,2 mol/L 尿素,pH12.0)溶解沉淀,將變性的包涵體裝入透析袋,用復(fù)性液Ⅰ(50 mmol/L Tris-Cl,0.1 mmol/L DTT,pH8.0)于4℃透析12 h,50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)于4℃透析12 h,復(fù)性液Ⅱ(50 mmol/L Tris-Cl,0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽,1 mmol/L 還原型谷胱甘肽,pH8.0)于4℃透析12 h;透析結(jié)束,4℃、12 000 r/min 離心30 min,收集上清和沉淀;包涵體復(fù)性產(chǎn)物用0.45 μm 濾器過濾,用GST 4B 純化試劑盒純化;用PBS 平衡GST 柱子后將復(fù)性產(chǎn)物上樣,充分洗去雜蛋白,用還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白,收集不同峰值樣品,經(jīng)12% SDS-PAGE和Western印跡鑒定。

    1.5.2 可溶性L1 蛋白的純化 經(jīng)12% SDS-PAGE鑒定,16℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為可溶性表達,在破碎菌體的上清和沉淀內(nèi)均有目的蛋白。大量表達HPV18 L1 蛋白,超聲波破碎菌體,收集上清,進行GST 4B親和純化。為去除分子伴侶,在破碎菌體中加入1 mmol/L ATP 孵育30 min,再加入3.5 mol/L尿素孵育30 min,4℃、14 400 r/min 離心75 min,收集上清,進行GST 4B親和純化。收集不同峰值的樣品,經(jīng)超濾管濃縮后,用50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)于4℃透析18 h。每毫升蛋白加入20 U 凝血酶,22℃孵育8 h,用Western印跡鑒定酶切結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

    HPV18 L1 基因全長1602 bp,編碼533 個氨基酸殘基。按照大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 基因序列后,密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)由0.228 上升為0.578,密碼子偏愛指數(shù)(CBI)由-0.09 上升為0.470,氨基酸序列未發(fā)生改變。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pMD18-T-L1的序列正確。

    2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 的雙酶切和PCR鑒定

    用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1,同時進行PCR 鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在1600 bp 處均有目的條帶(圖1),表明L1基因成功插入pGEX-4T-1載體。

    2.3 HPV18 L1蛋白原核表達的鑒定

    經(jīng)12% SDS-PAGE 檢測,在37℃用0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達4 h,L1 蛋白以包涵體形式存在,在相對分子質(zhì)量約86 000 處可見明顯條帶(圖2),與HPV18 L1-GST融合蛋白預(yù)期大小吻合。在16℃用0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h,L1 蛋白為可溶性表達,在破碎菌體的上清和沉淀中均有相對分子質(zhì)量約86 000的新增條帶,上清孔中約60 000的條帶為分子伴侶GroEL(圖3)。

    2.4 包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

    12% SDS-PAGE 結(jié)果表明,包涵體經(jīng)洗滌后雜蛋白減少,目的蛋白含量較高。經(jīng)堿變性溶解包涵體,大量菌體被溶解。蛋白復(fù)性后用GST 4B進行親和純化,在相對分子質(zhì)量約86 000 處有單一條帶,為HPV18L1-GST融合蛋白(圖4)。

    2.5 可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

    將破碎的菌體上清進行GST 4B親和純化,發(fā)現(xiàn)GroEL 和HPV18L1-GST 融合蛋白共同被純化,相對分子質(zhì)量分別為60 000 和86 000。但是,如果在超聲波破碎的菌體中加入ATP 和尿素作用后,經(jīng)GST 4B 親和層析純化可得到HPV18 L1-GST 融合蛋白,同時可去除GroEL(圖5)。

    圖1 重組質(zhì)粒的PCR(A)和酶切(B)鑒定

    圖2 HPV18 L1表達的SDS-PAGE分析

    圖3 HPV18 L1不同表達方式的SDS-PAGE分析

    圖4 以包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

    2.6 HPV18 L1-GST融合蛋白的Western印跡鑒定

    包涵體形式表達的HPV18 L1-GST融合蛋白純化后降解條帶較多,而可溶性表達的融合蛋白純化后條帶單一,無蛋白降解現(xiàn)象(圖6)。

    2.7 HPV18 L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

    可溶性表達的蛋白純化后得到的HPV18 L1-GST 融合蛋白條帶單一,經(jīng)凝血酶酶切后可去除GST 標(biāo)簽,Western 印跡檢測顯示在相對分子質(zhì)量60 000 處有明顯條帶,能被HPV18 L1 特異性抗體識別,為HPV18 L1蛋白,相對分子質(zhì)量42 000處的條帶為L1蛋白的降解產(chǎn)物(圖7)。

    3 討論

    圖5 以可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

    圖6 HPV18L1-GST融合蛋白的Western印跡

    圖7 HPV18L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

    外源基因在大腸桿菌中的高效表達受很多因素的影響。用pUC 表達載體表達HPV18 L1 蛋白時,目的蛋白發(fā)生降解,表達量低。本實驗采用了帶有GST 標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-1,GST 既能增加外源蛋白的可溶性,提高蛋白質(zhì)的表達量,又便于親合層析純化目的蛋白。本實驗構(gòu)建了pGEX-4T-1-HPV18 L1 重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)后HPV18 L1 以GST 融合蛋白的形式表達,SDS-PAGE 可見相對分子質(zhì)量86 000 條帶。37℃以0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達4 h,蛋白為包涵體形式,經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性和GST 4B 親和純化,可獲得HPV18 L1-GST 融合蛋白,但降解條帶較多。16℃以0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h,蛋白為可溶性形式,經(jīng)去除分子伴侶GroEL、GST 4B親和純化和凝血酶酶切去除GST標(biāo)簽,可獲得HPV18 L1純化蛋白,但酶切效率有待提高。

    尿素、鹽酸胍變性會破環(huán)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),使疏水性氨基酸殘基暴露在表面。包涵體溶解與尿素濃度、蛋白質(zhì)濃度和溶液pH 值有關(guān)。本實驗中,將包涵體在堿變性條件下溶解,將可溶部分用含有還原劑的中性緩沖液透析促進二硫鍵正確折疊,多余的還原劑可再次透析除去,大部分包涵體在50 mmol/L Tris(pH12.0)和2 mol/L 尿素中可以溶解。此方法既能保持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),又使蛋白質(zhì)溶解達到最大化[1]。在復(fù)性過程中,有許多條件影響目的蛋白的重折疊。一是細菌成分和雜蛋白的影響。低濃度尿素、TritonX-100 和EDTA 有利于除去脂類、脂多糖、核酸等雜質(zhì)。其次,復(fù)性時蛋白質(zhì)濃度很關(guān)鍵,蛋白質(zhì)濃度高于1 mg/mL,則復(fù)性得率低于10%,蛋白質(zhì)濃度為10~50 μg/mL時復(fù)性得率最高。三是小分子添加劑的使用。L1 蛋白含有12 個半胱氨酸殘基,為高度富含二硫鍵的蛋白質(zhì),DTT、氧化型和還原型谷胱甘肽能夠促進L1蛋白的正確折疊。

    將可溶性HPV18 L1 蛋白進行GST 4B 親和層析純化,同時得到分子伴侶GroEL 和HPV18L1-GST融合蛋白,這與Chen 的報道一致[2]。在蛋白質(zhì)折疊過程中,GroEL 結(jié)合伸展的肽鏈或折疊的中間態(tài),并在ATP 和GroES 的作用下,水解ATP 釋放底物蛋白質(zhì)和能量,促進底物蛋白質(zhì)的折疊。GroEL 可通過不同的作用力與各種底物結(jié)合,利用層析技術(shù)也不能使其分開,說明兩者之間存在相互作用。去除與底物多肽緊密結(jié)合的GroEL 有三種方法:一是通過ATP 和大腸桿菌變性蛋白質(zhì)的作用可以有效去除GroEL[3],但考慮到大腸桿菌變性蛋白中雜帶較多,我們未采取此方法。二是改變GroEL 的基因片段,使后期純化時無GroEL 存在[4]。三是ATP 和尿素共同作用去除GroEL。GroEL 具有ATP 激酶活性[5]。ATP 水解是誘導(dǎo)GroEL 構(gòu)象變化的關(guān)鍵,在ATP 的作用下,分子伴侶與目的蛋白之間從緊密結(jié)合變成疏松結(jié)合狀態(tài)。3.5 mol/L尿素可以打亂GroEL二級結(jié)構(gòu)[6]。ATP 結(jié)合GroEL 后,尿素能進一步誘導(dǎo)GroEL 和底物蛋白質(zhì)解聚,將目的蛋白從GroEL 上釋放出來,本研究即采用此法。

    大腸桿菌表達系統(tǒng)是表達外源蛋白質(zhì)的首選系統(tǒng)。若大腸桿菌中表達的蛋白折疊成對熱不穩(wěn)定的中間體,便會促進包涵體形成。低溫表達可降低翻譯速率,使蛋白質(zhì)有足夠時間正確折疊,并能減少重組蛋白的熱變性,因此,低溫培養(yǎng)條件能在一定程度上抑制包涵體的形成。雖然低溫表達時延長了外源蛋白誘導(dǎo)時間,但相對于其后包涵體變性、復(fù)性等步驟的繁瑣,目的蛋白含量的損失和天然活性的喪失,本實驗選擇低溫表達HPV18 L1 蛋白是可行的。本研究建立了HPV18 L1 融合蛋白的純化方法,酶切去除了GST 標(biāo)簽,獲得了HPV18 L1 蛋白,是后續(xù)疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。

    [1]Khan R H,Rao K B C,Eshwari A N S,et al.Solubilization of recombinant ovine growth hormone with retention of nativelike secondary structure and its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli[J].Biotechnol Prog,1998,14(5):722-728.

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