慢病毒載體介導(dǎo)的層黏連蛋白受體穩(wěn)定抑制細(xì)胞株的建立

武瑞琴，朱旭東，周曉巍，黃培堂

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.生物工程研究所；b.疾病預(yù)防控制所；北京 100071

層黏連蛋白受體（laminin receptor，LR）又稱層黏連蛋白結(jié)合蛋白（laminin binding protein，LBP），是細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，最早由Terranova 等[1]從人類乳腺癌細(xì)胞表面分離得到。已發(fā)現(xiàn)多種LR，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為整合素家族與非整合素家族兩大類。其中，對(duì)非整合素家族中相對(duì)分子質(zhì)量為67×103的LR（67kDa LR）的研究最為深入。67kDa LR通過疏水序列與層黏連蛋白的V 區(qū)/β1 鏈YIGSR 序列結(jié)合，廣泛分布在上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及大部分腫瘤細(xì)胞表面。層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白等構(gòu)成的基膜是構(gòu)成腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要屏障，因此LR在腫瘤細(xì)胞黏附和遷移過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2]。慢病毒是一種導(dǎo)入外源基因的有效手段，通過介導(dǎo)外源基因整合到宿主染色體上，可實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。此外，慢病毒的感染效率高，宿主細(xì)胞類型廣泛，且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性好，在基因的功能性研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。本研究的目的，是以慢病毒為載體，構(gòu)建LR 表達(dá)穩(wěn)定抑制的HeLa 細(xì)胞株，為深入探討LR 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa 細(xì)胞、293FT 細(xì)胞、慢病毒載體質(zhì)粒pLenti6/v5-EGFP、質(zhì)粒pUC-H1、兔抗LR 多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；包裝載體質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG 購(gòu)自Invitrogen 公司；引物及小發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）序列由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成；Pfu高保真DNA 聚合酶購(gòu)自上海生物工程有限公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；T4DNA連接酶、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒Maxipreps DNA purification System 購(gòu)自Promega 公司；膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 和Opti-MEM 購(gòu)自Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；羊抗α-actinin、HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP 標(biāo)記的抗兔IgG 購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 H1啟動(dòng)子的插入

從pUC-H1 載體中PCR 獲得H1 啟動(dòng)子，末端加入ClaⅠ位點(diǎn)，同時(shí)在H1啟動(dòng)子下游末端ClaⅠ位點(diǎn)之前引入NheⅠ和PacⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。擴(kuò)增H1 的引物為H1-sense（5'-AATTGGATCGATCCATGGAATTCGAACGCTGACG-3'）和H1-antisense（5'-AATTGGATATTTAATTAAGCTAGCGTGGTCTCAATACAGAACTTA-3'）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒對(duì)H1 條帶進(jìn)行回收純化；用ClaⅠ酶切pLenti6/v5-EGFP 載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切產(chǎn)物；將上述回收產(chǎn)物用T4DNA 連接酶連接得到pLenti6/v5-EGFP-H1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐西林的LB 平板上于37℃倒置培養(yǎng)過夜；菌落PCR篩選陽性克隆，將陽性克隆接種于含氨芐西林的LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，送華諾公司測(cè)序。

1.3 LR靶向shRNA序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI 中LR 的基因序列和Ambion 公司的pSolencer 說明書設(shè)計(jì)2條shRNA（表1），由北京奧科生物公司合成。

1.4 LR靶向shRNA序列的插入

將合成的shRNA 序列退火，使其形成雙鏈DNA；分別用PacⅠ和NheⅠ雙酶切shRNA 雙鏈和pLenti6/v5-EGFP-H1載體，1%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA 連接酶連接得到pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA；將上述載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)菌接種到含氨芐西林的LB平板上，于37℃倒置培養(yǎng)過夜；利用H1 上游引物和引物6、7 下游序列（引物6 antisense：5'-TTAATTAATTC CAAAAACCTTCACT-3'；引 物7 antisense：5'-TTA ATTAATTCCAAAAATAACAAGG-3'）進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆。

1.5 慢病毒的包裝和感染

將pLenti6/v5-EGFP-H1-LRshRNA 載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞匯合度達(dá)到90%的293FT 細(xì)胞，以pLenti6/v5-EGFP-H1 為陽性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后4 h 換成新鮮的DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS，1 mmol/L丙酮酸鈉，0.1 mmol/L 非必需氨基酸），轉(zhuǎn)染后72 h收獲并濃縮病毒，4℃、3000 r/min 離心15 min，取上清，加入終濃度為5×10-4g/L 的聚合賴氨酸（PLL），輕輕混勻，4℃孵育30 min，4℃、10 000 r/min 離心2 h，用DMEM重懸，分裝后于-70℃保存。

HeLa 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，感染前1 d 鋪至24 孔板。分別以含有LR-sh6、LR-sh7 及空白對(duì)照的病毒感染細(xì)胞，感染后48～72 h可在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光。

1.6 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

病毒感染后的HeLa細(xì)胞于第4 d加入4 μg/mL的殺稻瘟菌素（blasticidin），每隔3 d換一次抗生素，共篩選12 d。篩選后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用新鮮培養(yǎng)基稀釋后鋪96 孔板，保證每孔僅含1 個(gè)細(xì)胞，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出細(xì)胞克隆后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出綠色熒光的克隆即為陽性細(xì)胞克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)后，最終獲得陽性慢病毒感染的HeLa細(xì)胞系，即HeLa-LR-sh6和HeLa-LR-sh7。

1.7 real-time PCR 檢 測(cè)HeLa 細(xì)胞中LR 的mRNA表達(dá)水平

將HeLa 細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)shRNA 的HeLa-LR 細(xì)胞株鋪至24 孔板，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后提取總RNA。取0.5 μg 總RNA 為模板，以O(shè)ligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將cDNA 稀釋后作為模板，加入DNA 緩沖液、上下游引物、dNTP和Taqman 探針，進(jìn)行real-time PCR，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算LR mRNA的表達(dá)水平。

1.8 Western 印跡檢測(cè)HeLa 細(xì)胞中LR 的蛋白表達(dá)水平

用NP-40 細(xì)胞裂解液裂解已感染病毒的細(xì)胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min 收集上清，測(cè)定蛋白濃度后取一定量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，LR 兔抗和α-actinin 羊抗稀釋后室溫孵育1 h，二抗稀釋后室溫反應(yīng)1 h，加發(fā)光液后顯色，檢測(cè)LR蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 H1啟動(dòng)子的擴(kuò)增和插入

以pUC-H1 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增H1 啟動(dòng)子，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示得到260 bp 的片段（圖1）。將擴(kuò)增片段插入pLenti6/v5-EGFP 載體，對(duì)連接轉(zhuǎn)化的菌落進(jìn)行PCR 鑒定，得到多個(gè)陽性克?。▓D2）。挑選2、6、9、12 這4 個(gè)陽性克隆測(cè)序，結(jié)果表明插入的H1 啟動(dòng)子序列正確（序列略）。

2.2 pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA的構(gòu)建

將合成的單鏈shRNA 序列的正反鏈緩慢退火形成雙鏈，與經(jīng)NheⅠ和PacⅠ雙酶切的pLenti6/v5-EGFP-H1 載體連接，用H1 啟動(dòng)子上游引物和合成的LR-sh6 和LR-sh7 下游引物對(duì)連接轉(zhuǎn)化的菌落進(jìn)行PCR 鑒定（圖3），表明shRNA 片段連入pLenti6/v5-EGFP-H1，構(gòu)建成pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA載體，測(cè)序結(jié)果表明插入的外源序列正確（序列略）。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)LR 靶向shRNA 的HeLa 細(xì)胞株的獲得

圖1 H1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2 菌落PCR篩選陽性pLenti6/v5-EGFP-H1重組子

用構(gòu)建的pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh6 和pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh7 慢病毒載體包裝病毒后感染HeLa 細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)LR shRNA 的2 組共34 株HeLa-LR-sh6 和HeLa-LR-sh7 細(xì)胞，熒光顯微鏡下幾乎全部細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光（圖4）。

2.4 HeLa-LR-shRNA 細(xì)胞株中LR的抑制效果

對(duì)2組共34株細(xì)胞培養(yǎng)2 d后提取總RNA和蛋白，進(jìn)行real-time PCR 和Western 印跡，分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)HeLa細(xì)胞中LR 的表達(dá)。realtime PCR 結(jié)果顯示34 株細(xì)胞中有14 株LR 的表達(dá)受到明顯抑制，LR-sh6 和LR-sh7 在RNA 水平上都表現(xiàn)出了較好的LR 抑制作用，LR-sh7 的抑制效率最高可達(dá)90%（圖5）。Western 印跡顯示穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞中LR的蛋白水平明顯下降（圖6、7）。

3 討論

層黏連蛋白是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分。大量研究表明，LR 參與多種細(xì)胞活動(dòng)，不僅能夠介導(dǎo)病毒和朊蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用[4-5]，而且與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞之間的識(shí)別和組織細(xì)胞的衰老過程。

圖3 菌落PCR篩選pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA陽性重組子

圖4 穩(wěn)定表達(dá)LR靶向shRNA的HeLa細(xì)胞株

圖5 LR shRNA的抑制效率

圖6 HeLa-LR-sh6細(xì)胞LR蛋白的表達(dá)

圖7 HeLa-LR-sh7細(xì)胞LR蛋白的表達(dá)

研究表明，LR 的表達(dá)水平與很多腫瘤特別是上皮細(xì)胞腫瘤的惡性程度有關(guān)。在卵巢癌、肺癌及結(jié)腸癌中都發(fā)現(xiàn)LR 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)展階段呈正相關(guān)。Yow 等[6]的研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌中LR mRNA水平比鄰近的正常結(jié)腸上皮細(xì)胞高出近9 倍。在乳腺癌[7]、肝癌[8]中，LR 的高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤的局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。Berno等[9]針對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究表明，LR 可通過調(diào)控肌動(dòng)蛋白組裝，影響細(xì)胞的黏附和遷移，同時(shí)伴隨蛋白水解酶的活化。Horwitz等的研究結(jié)果則顯示，LR與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用影響腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可引起ERK、JNK 和p38MAPK的活化，從而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

為了深入研究LR在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向LR 的shRNA，并構(gòu)建了慢病毒載體。慢病毒載體可將shRNA 整合到宿主細(xì)胞的基因組中，通過篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)shRNA 的HeLa 細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性LR 在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)被沉默，而且抑制效果顯著。此細(xì)胞模型的建立，為體外研究LR 的生物學(xué)功能，尤其是LR 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)工具。

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