GST-pulldown驗證轉(zhuǎn)錄因子ZNF24與c-Myc的相互作用

趙靖凱，王聰，張籍鵬，厲建中

第二軍醫(yī)大學(xué)a.學(xué)員旅；b.藥學(xué)院生化藥學(xué)教研室；上海 200433

鋅指蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛地參與基因表達的調(diào)控。人類鋅指蛋白基因ZNF24（又稱ZNF191或KOX17）[1-2]由4 個外顯子組成，編碼包含368 個氨基酸殘基的類Krüppel 蛋白。鋅指蛋白或轉(zhuǎn)錄因子ZNF24的N端有富含亮氨酸（Leu）的SCAN結(jié)構(gòu)域（又稱LeR 結(jié)構(gòu)域），C端有4個連續(xù)的典型的類Krüppel 鋅指模體。Northern 印跡分析ZNF24的轉(zhuǎn)錄本，顯示其在心臟、肝、肺和脾中大量存在，也存在于泌尿生殖組織（腎、睪丸、卵巢和前列腺）、淋巴組織（淋巴結(jié)、胸腺和扁桃體）、小腸和結(jié)腸中，在大腦中低水平存在[2-3]。我們通過綠色熒光蛋白（GFP）報告基因亞細(xì)胞定位實驗，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白ZNF24 定位于細(xì)胞核上，其核定位信號位于C 端第一和第二類Krüppel鋅指區(qū)域[4]。鋅指蛋白ZNF24能特異地與基因組內(nèi)廣泛存在的（TCAT）n四核苷酸重復(fù)序列結(jié)合[3]。體外酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因內(nèi)含子Ⅰ上的TCAT 重復(fù)序列（微衛(wèi)星HUMTH01）通過與ZNF24 的結(jié)合對TH基因的表達具有數(shù)量抑制效應(yīng)[3-5]，TH基因編碼合成兒茶酚胺的限速酶；體外共轉(zhuǎn)染實驗表明，當(dāng)HUMTH01 等位基因與胸苷激酶的最小啟動子-報告基因融合時，ZNF24能促進其對報告基因表達的增強效應(yīng)[3]，暗示ZNF24 參與調(diào)控兒茶酚胺的合成。此外，在患神經(jīng)精神病和心血管疾病的患者中發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺能傳遞失調(diào)[3,6]。最近的研究表明，ZNF24 是少突膠質(zhì)細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成以及維持神經(jīng)祖細(xì)胞分裂狀態(tài)所必需的[7-8]。

小鼠鋅指蛋白ZF-12（又稱Zfp191，是ZNF24 的同源基因產(chǎn)物）與ZNF24有94%同源性，是人與小鼠SCAN 家族成員同源比對中一致性最高的蛋白[9]。ZF-12是Prost 等首先克隆得到的一個參與軟骨分化的相關(guān)基因[10]。我們首次克隆了其全長基因組序列，發(fā)現(xiàn)其與鋅指蛋白基因Zfp-35相連鎖，位于18號染色體的B3-C 帶上[11]，同時還克隆了一個ZF-12假基因[12]。鋅指蛋白ZF-12 在小鼠各種組織中廣泛表達，小鼠多組織Northern 印跡分析表明，在發(fā)育過程中，小鼠ZF-12的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在胚胎期6.5～11 d 逐漸增加并達到最高水平，并在隨后不同的發(fā)育階段保持相對恒定[10,13]。這些研究暗示鋅指蛋白ZF-12 除參與軟骨分化外，還有其他重要的未闡明的生理功能。以人ZNF24為探針對大鼠的多組織Northern 印跡分析表明，ZF-12mRNA 在大鼠的大腦中也是低水平存在的，而在兒茶酚胺能組織（黑質(zhì)、下丘腦和嗅球）中高水平存在，在紋狀體、皮質(zhì)和中腦中較低水平存在。令人感興趣的是腎上腺（外周兒茶酚胺能組織）中也存在大量ZF-12mRNA。大鼠胚胎的整個頭部存在高水平的ZF-12mRNA，暗示ZF-12 可能參與大腦的發(fā)育[3]。最近的研究表明，ZNF24 或ZF-12 為少突膠質(zhì)細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成及維持神經(jīng)祖細(xì)胞分裂狀態(tài)所必需[7-8]；蛋白組學(xué)實驗表明ZNF24 是DNA 復(fù)制因子[14]。但是，我們通過原核顯微注射獲得的ZNF24 轉(zhuǎn)基因小鼠生長發(fā)育正常，未見明顯的病理和行為改變[15]。另外，我們通過胚胎干細(xì)胞（ES 細(xì)胞）基因打靶獲得了ZF-12+/-ES 細(xì)胞[16]；通過囊胚腔顯微注射獲得的ZF-12+/-小鼠生長發(fā)育正常，而ZF-12-/-胚胎發(fā)育明顯滯后，發(fā)育約7.5 d 的胚胎死亡[17]。令人感興趣的是，小鼠胚胎早期發(fā)育過程中ZF-12 的表達主要集中于增殖區(qū)域[13]，小干擾RNA（siRNA）下調(diào)ZF-12可顯著抑制神經(jīng)祖細(xì)胞增殖[8]，這部分解釋了ZF-12-/-胚胎死亡的原因。這些研究表明鋅指蛋白ZNF24或ZF-12 具有重要的生理功能，暗示其參與調(diào)控不同的功能基因。我們通過基因過表達與siRNA 干擾結(jié)合基因芯片技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)ZNF24 參與激酶轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控、血管增生、腦發(fā)育與DNA 損傷應(yīng)答等，是多功能的因子[18]。最近，我們的酵母雙雜交實驗表明ZNF24 與組蛋白H2AZ 存在相互作用[19]，其中另一陽性克隆編碼c-Myc 蛋白。在此，我們利用GST-pulldown實驗進一步驗證ZNF24與c-Myc的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株，pcDNA3.1和pGEX-4T-2 載體由本實驗室保存；氨芐西林（Amp）溶液（100 mg/mL）、卡那霉素（Kan）溶液（35 mg/mL）購自上海博光生物公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶等工具酶及PCR 相關(guān)試劑購自TakaRa 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA）溶液及其他相關(guān)試劑由本實驗室配制。

1.2 基因克隆

1.2.1ZNF24基因的克隆 查詢NCBI 數(shù)據(jù)庫中ZNF24的編碼序列，選擇其中的BglⅡ和XhoⅠ位點作為酶切位點，設(shè)計上游引物（5'-GGCAGATCTTC TGCACAGTCAGTGGAA-3'）和下游引物（5'-GGCC TCGAGTTAAACTTTCACAACATTC-3'），交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以HEK293 細(xì)胞的cDNA為模板，PCR擴增得到目的基因。

1.2.2c-Myc基因的克隆 查詢NCBI 數(shù)據(jù)庫中c-Myc的編碼序列，選擇其中的ApaⅠ和KpnⅠ位點作為酶切位點，設(shè)計上游引物（5'-ATTGGGCCCATGG ATTTTTTTCGGGTAGTGGA-3'）和下游引物（5'-AT CGGTACCGACGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3'），交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以HEK293細(xì)胞的cDNA為模板，PCR擴增得到目的基因。

1.3 載體構(gòu)建

1.3.1 載體pGEX-4T-2-ZNF24 的構(gòu)建ZNF24的PCR 產(chǎn)物和pGEX-4T-2 載體分別經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收ZNF24目的片段和pGEX-4T-2 載體骨架片段，用T4DNA 連接酶將二者連接，隨后用該體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α得到pGEX-4T-2-ZNF24 載體，經(jīng)酶切鑒定大小和方向正確后，DNA測序驗證。

1.3.2 載體pcDNA3.1-c-Myc 的構(gòu)建c-Myc的PCR 產(chǎn)物和pcDNA3.1 載體分別經(jīng)ApaⅠ和KpnⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收c-Myc目的片段和pcDNA3.1 載體骨架片段，用T4DNA 連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α得到pcDNA3.1-c-Myc載體，經(jīng)酶切鑒定大小和方向正確后，DNA 測序驗證。

1.4 融合蛋白的表達與純化

1.4.1 GST-ZNF24 融合蛋白的原核表達與純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-ZNF24 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，挑取單個克隆到裝有5 mL LB（含100μg/mL Amp）的10 mL 試管里，37℃培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到裝有500 mL LB（含100μg/mL Amp）的1 L 錐形瓶中，37℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm值為1.0～1.5，加入IPTG（終濃度1 mmol/L），28℃培養(yǎng)8 h，6000 r/min 離心10 min，4℃離心收集細(xì)菌，棄上清，將菌體沉淀于-20℃放置；室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500 mL培養(yǎng)液加入10～20 mL細(xì)菌裂解液（PBS+1% Triton-100+PMSF），吹打混勻，冰上超聲波破碎（開2 s，停9 s，40～60 min）至裂解液變清，11 000 r/min 離心15 min，4℃離心分離上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 c-Myc 融合蛋白的真核表達與純化 將編碼c-Myc 蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白的真核表達載體pcDNA3.1上，進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，常規(guī)表達、純化。

1.5 GST-pulldown實驗

取適量融合蛋白GST-ZNF24 于冰上凍融；取50～70μL GST-beads（Immobilized Glutathione）到EP 管中，用800μL PBS+1% Triton-100 潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-ZNF24 與之混勻，4℃層析柜中旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h，用PBS+1% Triton-100 洗3 次，PBS洗3 次，留取20μL（PBS+beads）作為Offer。裂解真核融合蛋白c-Myc，棄培養(yǎng)基，用PBS 洗一次，加入300μL 裂解液（以6 孔為例，PBS+1% Triton-100+Cocktaier），4℃放置30 min，吹打收集至1.5 mL EP管中，超聲波破碎，13 000 r/min 離心15 min，4℃離心取上清，BCA 蛋白定量（optional）留取20μL 作為Offer，其余樣品加入已純化蛋白的EP 管中，用PBS補足600μL，以便蛋白之間能充分結(jié)合，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合。用PBS+1% Triton-100 洗3 次，PBS 洗3 次。40μL 5×上樣緩沖液溶解beads上的蛋白，煮沸3 min，高速離心，行SDS-PAGE，Western印跡檢測。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-4T-2-ZNF24的構(gòu)建與鑒定

按照前述方法，通過PCR 擴增獲得ZNF24的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-2載體，分別經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，ZNF24條帶約為1.1 kb，pGEX-4T-2 條帶約為4.5 kb，均符合預(yù)期（圖1）。經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，得到pGEX-4T-2-ZNF24 載體，經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2，較大片段為pGEX-4T-2 載體骨架，較小片段為ZNF24，均符合預(yù)期。DNA 測序（序列未示）表明與GenBank 中的ZNF24基因序列一致性高達99%，其讀框符合預(yù)期。

圖1 ZNF24和pGEX-4T-2的BglⅡ、XhoⅠ雙酶切

2.2 pcDNA3.1-c-Myc的構(gòu)建與鑒定

按照前述方法，通過PCR 擴增獲得c-Myc的PCR 產(chǎn)物和pcDNA3.1 載體，分別經(jīng)ApaⅠ和KpnⅠ雙酶切，c-Myc條帶約為1.5 kb，pcDNA3.1 條帶約為5.4 kb，均符合預(yù)期（圖3）。經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，得到pcDNA3.1-c-Myc 載體，經(jīng)ApaⅠ和KpnⅠ雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4，較大片段為pcDNA3.1 載體骨架，較小片段為c-Myc，均符合預(yù)期。DNA 測序（序列未示）表明與GenBank中的c-Myc基因序列一致性高達99%，其讀框符合預(yù)期。

圖2 BglⅡ和XhoⅠ雙酶切pGEX-4T-2-ZNF24

圖3 c-Myc和pcDNA3.1的ApaⅠ、KpnⅠ雙酶切

圖4 ApaⅠ和KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1-c-Myc

2.3 重組蛋白ZNF24的誘導(dǎo)表達

用經(jīng)測序驗證正確的pGEX-4T-2-ZNF24 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在28℃條件下用IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，獲得的蛋白與推測的融合蛋白大小相符。取適量表達菌液培養(yǎng)上清進行SDSPAGE，結(jié)果如圖5，加入IPTG 誘導(dǎo)后pGEX-4T-2-ZNF24表達了目的蛋白。

2.4 GST-pulldown

采用GST-pulldown 驗證原核融合蛋白GSTZNF24 與真核融合蛋白c-Myc 的體外相互作用。原核融合蛋白GST-ZNF24 與GST-beads 結(jié)合，經(jīng)層析純化后，再將真核融合蛋白c-Myc 的細(xì)胞裂解液與GST-ZNF24充分結(jié)合，用上樣緩沖液將結(jié)合在GSTbeads 上的蛋白溶解，樣品處理后進行SDS-PAGE，用Western 印跡檢測，結(jié)果如圖6，泳道1為ZNF24與c-Myc 結(jié)合后相互作用的條帶，所用一抗為抗c-Myc；泳道2所加樣品為GST空載體表達蛋白；泳道3為GST-ZNF24蛋白，所用一抗為抗ZNF24；泳道4所加樣品為GST 空載體表達蛋白，不結(jié)合c-Myc 蛋白，無條帶。

3 討論

圖5 SDS-PAGE分析pGEX-4T-2-ZNF24的誘導(dǎo)表達

圖6 GST-pulldown驗證ZNF24與c-Myc的體外相互作用

ZNF24定位于染色體18q12.1[2]，該區(qū)域的缺失常在人類多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如浸潤性乳腺癌[20]、結(jié)腸癌[21-22]、胃賁門腺癌[23]、睪丸生殖細(xì)胞瘤[24]、造血惡性腫瘤[25]等。此外，ZNF24mRNA在卵巢惡性腫瘤、結(jié)腸癌和乳腺癌組織中的表達顯著下調(diào)[26-27]。這些結(jié)果提示ZNF24可能參與乳腺癌結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生或發(fā)展的負(fù)調(diào)控。有文獻報道了ZNF24與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的負(fù)相關(guān)性：人結(jié)腸癌和乳腺癌組織中ZNF24基因表達水平與其癌旁組織相比顯著下調(diào)而VEGF表達顯著上調(diào)；ZNF24的過表達導(dǎo)致VEGF表達下調(diào)，而用siRNA干擾沉默ZNF24導(dǎo)致VEGF表達上調(diào)；ZNF24與VEGF啟動子報告基因共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺瘤細(xì)胞導(dǎo)致VEGF啟動子活性顯著下調(diào)[26,28]。在CHO和NIH3T3 細(xì)胞中，鋅指蛋白ZNF24 具有GAL4 啟動子轉(zhuǎn)錄抑制活性[2]。這些結(jié)果提示ZNF24 參與VEGF 的負(fù)調(diào)控[26,28]。同樣，我們通過ZNF24過表達與siRNA 干擾實驗，發(fā)現(xiàn)ZNF24 參與血小板衍生生長因子受體β（PDGFR-β）的轉(zhuǎn)錄抑制[29]。另有研究證明，c-Myc與雌激素受體α（ERα）相鄰結(jié)合于VEGF啟動子上，參與VEGF 的雌激素調(diào)控[30]；c-Myc 可通過促進VEGFmRNA 的翻譯起始，從而提高VEGF 的蛋白表達水平[31]；c-Myc可抑制VEGF、PDGFR-β的表達[30,32-34]；c-Myc 參與PDGFR-β的轉(zhuǎn)錄抑制[33]；VEGF、c-Myc和PDGFR-β的高表達與多種腫瘤相關(guān)[35-36]。本研究結(jié)果表明ZNF24與c-Myc 相互作用。另外，我們分析了VEGF與PDGFR-β的啟動子序列，都不存在ZNF24特異結(jié)合的（TCAT）n重復(fù)序列，這提示ZNF24 可能是通過與c-Myc 相互作用實現(xiàn)其對VEGF、PDGFR-β的轉(zhuǎn)錄抑制。

[1]厲建中,李堅,傅繼梁.鋅指蛋白基因ZNF191[J].生命的化學(xué),2001,21(2):116-117.

[2]Han Z G,Zhang Q H,Ye M,et al.Molecular cloning of six novel Krüppel-like zinc finger genes from hematopoietic cells and identification of a novel transregulatory domain KRNB[J].J Biol Chem,1999,274(50):35741-35748.

[3]Albanese V,Biguet N F,Kiefer H,et al.Quantitative effects on gene silencing by allelic variation at a tetranucleotide microsatellite[J].Hum Mol Genet,2001,10(17):1785-1792.

[4]Li J Z,Chen X,Gong X L,et al.Identification of a functional nuclear localization signal mediating nuclear import of the zinc finger transcription factor ZNF24[J].PLoS One,2013,8(11):e79910.

[5]Meloni R,Biguet N F,Mallet J.Post-genomic era and gene discovery for psychiatric diseases:there is a new art of the trade? The example of the HUMTH01 microsatellite in the tyrosine hydroxylase gene[J].Mol Neurobiol,2002,26(2-3):389-403.

[6]Rodriguez S,Huang S,Chen X H,et al.A study of TH01 and IGF2-INS-TH haplotypes in relation to smoking initiation in three independent surveys[J].Pharmacogenet Genomics,2006,16(1):15-23.

[7]Sillars-Hardebol A H,Carvalho B,de Wit M,et al.Identification of key genes for carcinogenic pathways associated with colorectal adenoma-to-carcinoma progression[J].Tumour Biol,2010,31(2):89-96.

[8]Khalfallah O,Ravassard P,Lagache C S,et al.Zinc finger protein 191(ZNF191/Zfp191) is necessary to maintain neural cells as cycling progenitors[J].Stem Cells,2009,27(7):1643-1653.

[9]Edelstein L C,Collins T.The SCAN domain family of zinc finger transcription factors[J].Gene,2005,359:1-17.

[10]Prost J F,Negre D,Cornet-Javaux F,et al.Isolation,cloning,and expression of a new murine zinc finger encoding gene[J].Biochim Biophys Acta,1999,1447(2-3):278-283.

[11]厲建中,陳霞,王水良,等.小鼠鋅指蛋白基因ZF-12的克隆與基因結(jié)構(gòu)以及5'端啟動子活性的分析[J].遺傳學(xué)報,2003,30(4):311-316.

[12]厲建中,張亞洲,王水良,等.一個與小鼠鋅指蛋白基因ZF-12相關(guān)的假基因的克隆和鑒定[J].實驗生物學(xué)報,2002,35(2):127-133.

[13]Khalfallah O,Faucon-Biguet N,Nardelli J,et al.Expression of the transcription factor Zfp191 during embryonic development in the mouse[J].Gene Expr Patterns,2008,8(3):148-154.

[14]Lopez-Contreras A J,Ruppen I,Nieto-Soler M,et al.A proteomic characterization of factors enriched at nascent DNA molecules[J].Cell Rep,2013,3(4):1105-1116.

[15]Li J Z,Chen X,Yang H,et al.Establishment of transgenic mice carrying gene encoding human zinc finger protein 191[J].World J Gastroenterol,2004,10(2):264-267.

[16]厲建中,楊樺,傅繼梁.小鼠鋅指蛋白基因ZF-12 基因剔除的ES細(xì)胞系的建立[J].遺傳學(xué)報,2002,29(10):860-864.

[17]Li J,Chen X,Yang H,et al.The zinc finger transcription factor 191 is required for early embryonic development and cell proliferation[J].Exp Cell Res,2006,312(20):3990-3998.

[18]Li J,Chen X,Gong X,et al.A transcript profiling approach reveals the zinc finger transcription factor ZNF191 is a pleiotropic factor[J].BMC Genomics,2009,10:241.

[19]Li J,Chen X,He J,et al.A yeast two-hybrid screen identifies histone H2A.Z as a transcription factor ZNF24 interactor[J].J Cell Biochem,2012,113(11):3411-3418.

[20]Richard F,Pacyna-Gengelbach M,Schluns K,et al.Patterns of chromosomal imbalances in invasive breast cancer[J].Int J Cancer,2000,89(3):305-310.

[21]Kern S E,Fearon E R,Tersmette K W,et al.Clinical and pathological associations with allelic loss in colorectal carcinoma [corrected][J].JAMA,1989,261(21):3099-3103.

[22]Vogelstein B,Fearon E R,Hamilton S R,et al.Genetic alterations during colorectal-tumor development[J].N Engl J Med,1988,319(9):525-532.

[23]van Dekken H,Alers J C,Riegman P H,et al.Molecular cytogenetic evaluation of gastric cardia adenocarcinoma and precursor lesions[J].Am J Pathol,2001,158(6):1961-1967.

[24]Skotheim R I,Kraggerud S M,Fossa S D,et al.Familial/bilateral and sporadic testicular germ cell tumors show frequent genetic changes at loci with suggestive linkage evidence[J].Neoplasia,2001,3(3):196-203.

[25]Tune C E,Pilon M,Saiki Y,et al.Sustained expression of the novel EBV-induced zinc finger gene,ZNFEB,is critical for the transition of B lymphocyte activation to oncogenic growth transformation[J].J Immunol,2002,168(2):680-688.

[26]Harper J,Yan L,Loureiro R M,et al.Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24[J].Cancer Res,2007,67(18):8736-8741.

[27]張慧,崔英,余龍.ZNF191 mRNA在卵巢惡性腫瘤中的表達及臨床意義[J].第二軍醫(yī)學(xué)學(xué)報,2003,24(12):1381-1382.

[28]Jia D,Hasso S M,Chan J,et al.Transcriptional repression of VEGF by ZNF24:mechanistic studies and vascular consequences in vivo[J].Blood,2013,121(4):707-715.

[29]Li J,Chen X,Liu Y,et al.The transcriptional repression of platelet-derived growth factor receptor-beta by the zinc finger transcription factor ZNF24[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,397(2):318-322.

[30]Dadiani M,Seger D,Kreizman T,et al.Estrogen regulation of vascular endothelial growth factor in breast cancer in vitro and in vivo:the role of estrogen receptor alpha and c-Myc[J].Endocr Relat Cancer,2009,16(3):819-834.

[31]Mezquita P,Parghi S S,Brandvold K A,et al.Myc regulates VEGF production in B cells by stimulating initiation of VEGF mRNA translation[J].Oncogene,2005,24(5):889-901.

[32]Yang W,Wetterskog D,Matsumoto Y,et al.Kinetics of repression by modified p53 on the PDGF beta-receptor promoter[J].Int J Cancer,2008,123(9):2020-2030.

[33]Uramoto H,Hackzell A,Wetterskog D,et al.pRb,Myc and p53 are critically involved in SV40 large T antigen repression of PDGF beta-receptor transcription[J].J Cell Sci,2004,117(17):3855-3865.

[34]Izumi H,Molander C,Penn L Z,et al.Mechanism for the transcriptional repression by c-Myc on PDGF beta-receptor[J].J Cell Sci,2001,114(8):1533-1544.

[35]Kuwai T,Nakamura T,Sasaki T,et al.Targeting the EGFR,VEGFR,and PDGFR on colon cancer cells and stromal cells is required for therapy[J].Clin Exp Metastasis,2008,25(4):477-489.

[36]George D.Platelet-derived growth factor receptors:a therapeutic target in solid tumors[J].Semin Oncol,2001,28(5 Suppl 17):27-33.