病原菌多糖基因簇在大腸桿菌中的克隆

王雯，孫鵬，徐敏銳，徐威，吳軍

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.安徽大學(xué)，安徽 合肥 230601

許多病原菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、莢膜多糖（capsule polysacharides，CPS）往往是其重要的保護(hù)性抗原[1]，利用其多糖制備的多糖疫苗已上市多年。然而，多糖是T 細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，在人體內(nèi)不能引起免疫記憶效應(yīng)[2-3]，特別是在2 歲以下兒童和老年人體內(nèi)無(wú)法產(chǎn)生具有保護(hù)水平的抗體[4]。如果將多糖和蛋白交聯(lián)在一起，多糖-蛋白結(jié)合物便成為T(mén) 細(xì)胞依賴(lài)性抗原，在人體內(nèi)能引起免疫記憶效應(yīng)。因此，現(xiàn)在基于細(xì)菌多糖的疫苗其研發(fā)重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向多糖-蛋白結(jié)合疫苗[5-8]?，F(xiàn)有多糖-蛋白結(jié)合疫苗均采用化學(xué)法制備，該過(guò)程存在以下一些問(wèn)題：①大規(guī)模培養(yǎng)病原菌提取多糖有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)；②通過(guò)化學(xué)方法提取的多糖純度較低，質(zhì)控困難；③產(chǎn)物均一性差，純化困難；④得率低，成本高[9]。

近年來(lái)，在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了N-糖基化和O-糖基化修飾系統(tǒng)，建立了基于N-糖基化修飾系統(tǒng)的生物交聯(lián)技術(shù)[10]，并在大腸桿菌中分別利用痢疾桿菌O-多聚糖（OPS）和金黃色葡萄球菌CPS 修飾了重組綠膿桿菌外毒素A（rEPA），制備了痢疾多糖結(jié)合疫苗和金黃色葡萄球菌多糖結(jié)合疫苗[11]。目前痢疾多糖結(jié)合疫苗已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，金黃色葡萄球菌多糖結(jié)合疫苗在準(zhǔn)備進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

但是，N-糖基化修飾系統(tǒng)的寡糖轉(zhuǎn)移酶PglB 對(duì)多糖底物有一定的要求：多糖還原末端第一位糖基的C2位必須有乙酰氨基，且第二位糖基不能以β（1-4）糖苷鍵與其連接[12-14]。而病原菌多糖多種多樣，許多病原菌多糖的還原末端第一位糖基的C2 位并沒(méi)有乙酰氨基[15-16]，這將嚴(yán)重限制N-糖基化修飾系統(tǒng)在多糖結(jié)合疫苗研制領(lǐng)域的應(yīng)用。相比之下，O-糖基化修飾系統(tǒng)的寡糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)多糖底物特異性較低，可將C2位無(wú)乙酰氨基的多糖轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)蛋白的糖基化位點(diǎn)上。為此，本課題組前期選取大腸桿菌K12 系列菌株W3110 開(kāi)展了基于腦膜炎奈瑟球菌O-糖基化修飾系統(tǒng)的生物交聯(lián)技術(shù)[17]。W3110 因O-多糖合成途徑中的鼠李糖轉(zhuǎn)移酶基因wbbL插入失活而不能合成O-多糖。另外，利用Red 重組[18-19]技術(shù)敲除W3110 中O抗原連接酶基因waaL，構(gòu)建了O-多糖及脂多糖連接酶缺陷的大腸桿菌CLM24 作為宿主菌，從而解決了LPS 合成途徑與糖基化修飾途徑競(jìng)爭(zhēng)“異源多糖”的問(wèn)題，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了糖基工程大腸桿菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL。如果進(jìn)一步將外源多糖基因簇功能整合到此系統(tǒng)中，即可獲得多糖-蛋白結(jié)合物。但是，病原菌LPS 的O-多糖基因簇一般包含數(shù)十個(gè)基因，長(zhǎng)度達(dá)20～30 kb。本研究的目的就是以大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973及銅綠假單胞桿菌CMCC10110 為研究對(duì)象，將具有功能的外源O-多糖合成基因簇大片段功能整合到糖基工程大腸桿菌中，從而為在大腸桿菌中建立基于O-糖基化的生物交聯(lián)多糖-蛋白結(jié)合疫苗構(gòu)建技術(shù)提供基礎(chǔ)。1992 年，Shizuya 等[20]描述了一種可以克隆長(zhǎng)片段DNA 的細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC），此系統(tǒng)以大腸桿菌F 因子為基礎(chǔ)載體。F 因子具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)且維持在低拷貝（每個(gè)細(xì)胞中有1～2 個(gè)拷貝）的環(huán)境下，從而減少了質(zhì)粒中潛在的DNA 片段之間重組的幾率。此外，F(xiàn) 因子可攜帶長(zhǎng)達(dá)1 Mb 的外源DNA，這也同時(shí)表明F因子適合DNA大片段克隆。而建立基于細(xì)菌糖基化修飾系統(tǒng)的生物交聯(lián)技術(shù)制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗，依賴(lài)于外源多糖基因簇的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。我們以基于F 質(zhì)粒的細(xì)菌人工染色體pCC1BAC 為載體，以大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973 及銅綠假單胞桿菌CMCC10110 為研究對(duì)象，構(gòu)建了外源病原菌多糖合成基因簇的克隆載體，并研究了其在大腸桿菌中參與LPS 合成和修飾底物蛋白的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)BALB/c 雌性小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供；菌株和質(zhì)粒來(lái)源見(jiàn)表1。PrimerSTAR GXL DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶及長(zhǎng)片段連接酶試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶購(gòu)自NEB 公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG 購(gòu)自TransGen 公司；重蒸酚、RNase、DNaseⅠ、蛋白酶K 購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌O157 型、弗氏志賀菌α2a 型抗血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社；引物（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA 序列服務(wù)由北京華大基因有限公司提供；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。

1.2 PCR擴(kuò)增外源多糖基因簇及BAC載體片段

根據(jù) GenBank 公布的大腸桿菌 O157（AF061251.1）、甲型副傷寒沙門(mén)菌ATCC 9150 株（CP000026.1）、銅綠假 單胞桿 菌 PAO1 株（AE004091.2）基因序列，分別以大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973 及銅綠假單胞桿菌CMCC10110 基因組為模板，分別以O(shè)157-5'與O157-3'、50973 OPS-5'與50973 OPS-3'、10110 OPS-5'與10110 OPS-3'為引物，用PrimerSTAR GXL DNA 聚合酶分別擴(kuò)增帶有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110 的O-多糖合成基因簇；另以載體pCC1BACTM 質(zhì)粒為模板、BAC-5'與BAC-3'為引物，用Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶擴(kuò)增帶有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的線(xiàn)性片段。

1.3 多糖基因簇重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110多糖合成基因簇片段及BAC 載體片段用SfiⅠ酶切后，用DNA ligation kit LONG 長(zhǎng)片段連接試劑盒于16℃連接3 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，分別用O-多糖合成基因簇中前中后3對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定，從3對(duì)引物鑒定均為陽(yáng)性的克隆中提取質(zhì)粒，酶切進(jìn)一步鑒定，將PCR鑒定和酶切鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒分別命名為BAC-O157、BAC-50973和BAC-10110。

表1 菌株與質(zhì)粒

表2 引物設(shè)計(jì)

1.4 銅綠假單胞桿菌CMCC10110 LPS 的制備及測(cè)定

采用熱酚水法制備、純化銅綠假單胞桿菌CMCC10110 的LPS，具體操作參照文獻(xiàn)[18]；采用銀染法對(duì)純化的LPS 進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參照文獻(xiàn)[21]；采用苯酚硫酸法測(cè)定葡萄糖濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)所得方程，計(jì)算出銅綠假單胞桿菌CMCC10110 的LPS濃度，具體操作參照文獻(xiàn)[21]。

1.5 銅綠假單胞桿菌抗血清的制備

用甲醛滅活銅綠假單胞桿菌CMCC10110 后制備抗血清，具體操作參照文獻(xiàn)[22]；將制備好的滅活菌配制成10、20 及40 mg/mL 濃度梯度，作為免疫原接種BALB/c小鼠，具體操作參照文獻(xiàn)[21]，用間接ELISA法測(cè)抗體效價(jià)。

1.6 多糖基因簇克隆載體的功能鑒定

將重組質(zhì)粒BAC-O157、BAC-50973和BAC-10110電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12系列菌株W3110，構(gòu)建相應(yīng)的重組菌W3110/BAC-O157、W3110/BAC-50973及W3110/BAC-10110。K12 系列大腸桿菌因O-多糖合成途徑中的鼠李糖轉(zhuǎn)移酶基因wbbL插入失活，因此不能合成O-多糖，從而為W3110 利用外源O-多糖合成自身的“異源LPS”奠定了基礎(chǔ)。挑取重組克隆至含終濃度為30μg/mL 氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，對(duì)照菌株至無(wú)抗LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，4500 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用PBST 洗3 次，加入5%的奶粉，37℃孵育2 h，菌體于4500 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBST洗3次，加入稀釋的抗血清，37℃孵育1.5 h，菌體于4500 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBST洗3次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h，菌體于4500 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用PBST 洗3 次，用100μL PBST 重懸，于各反應(yīng)孔中加入30μL 菌液后加入100μL 顯色液，放置30 s，加入50μL 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)。

1.7 靶標(biāo)蛋白PilE O-糖基化修飾的鑒定

將重組質(zhì)粒BAC-O157、BAC-50973及BAC-10110分別電擊轉(zhuǎn)化糖基工程大腸桿菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL，構(gòu)建重組菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BACO157、CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-50973和CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-10110。挑取重組克隆于含30μg/mL 氯霉素、50μg/mL 卡那霉素和100μg/mL 氨芐西林的三抗Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基（20 g/L 酵母抽提物、10 g/L胰蛋白胨、50 mmol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液、10 g/L葡萄糖）中，37℃培養(yǎng)至D600nm約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，離心棄上清收集沉淀，用A 液（20 mmol/L pH7.5 磷酸鹽緩沖液）重懸，超聲波破菌離心后棄沉淀，用陽(yáng)離子柱純化（A 液：20 mmol/L pH7.5 磷酸鹽緩沖液；B 液：20 mmol/L pH8.0 磷酸鹽 緩沖液；C 液：20 mmol/L pH8.0 磷酸鹽緩沖液、1 mol/L NaCl），純化后樣品進(jìn)行Western印跡鑒定。

2 結(jié)果

2.1 多糖基因簇的克隆及重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank 公布的大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌ATCC 9150 株、銅綠假單胞桿菌PAO1 株基因序列合成引物。因?yàn)槎嗵呛铣苫虼仄屋^大而不易克隆，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)片段PCR 方法進(jìn)行了優(yōu)化，用PrimerSTAR GXL DNA 聚合酶進(jìn)行兩步法PCR，獲得大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110O-多糖合成基因簇片段，片段大小分別為16、32、24 kb（圖1）。根據(jù)GenBank 公布的基因序列對(duì)大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110 設(shè)計(jì)小片段鑒定引物（表2），利用PCR 方法進(jìn)行克隆篩選，選取三段皆為陽(yáng)性的克隆菌株，構(gòu)建了大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110多糖基因簇重組質(zhì)粒BAC-O157、BAC-50973及BAC-10110。用鑒定引物對(duì)重組質(zhì)粒BAC-O157、BAC-50973及BAC-10110進(jìn)行鑒定，分別獲得了與公布的序列大小一致的大腸桿菌O157wbdN（800 bp）、gmd1（1 kb）、wbdR（700 bp）片段，甲型副傷寒沙門(mén)菌ATCC 9150galF（1 kb）、rfbV（1 kb）、ugd（1 kb）片段，銅綠假單胞桿菌PAO1wzz（1 kb）、wbpL（1 kb）、wbpM（2 kb）片段（圖2）。將此3 種質(zhì)粒用SfiⅠ酶切，進(jìn)一步鑒定得到大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110多糖基因簇片段及BAC 載體片段（8 kb）（圖3）。用BAC 載體上的引物對(duì)重組質(zhì)粒O-多糖合成基因簇片段進(jìn)行5'及3'端測(cè)序，結(jié)果與GenBank 公布結(jié)果一致。

圖1 外源O-多糖合成基因簇的PCR擴(kuò)增

2.2 銅綠假單胞桿菌CMCC10110 LPS 抗血清的制備

由于銅綠假單胞桿菌CMCC10110 血清型未知，無(wú)法商業(yè)化得到相應(yīng)的O-多糖抗體，因此我們采用熱酚水法提取了銅綠假單胞桿菌CMCC10110 的LPS，利用銀染法對(duì)純化的LPS 進(jìn)行檢測(cè)。15%SDS-PAGE 銀染結(jié)果顯示，銅綠假單胞桿菌CMCC10110 的LPS 電泳圖譜呈現(xiàn)特異性的梯狀條帶，且條帶深淺與LPS含量成正比（圖4）。用苯酚硫酸法檢測(cè)樣品中的多糖含量，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖5）。待測(cè)樣品的D490nm值為1.185±0.007，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得樣品中LPS 含量為（1072.82±1.91）μg/mL。將此濃度的LPS 稀釋至1/100 后包板，用間接ELISA 法測(cè)定小鼠血清中LPS 的抗體滴度（圖6），血清GMT 最低值為350，表明間接ELISA 結(jié)果良好，可以將此血清用于后續(xù)ELISA及Western印跡檢測(cè)。

2.3 外源多糖基因簇克隆載體在大腸桿菌中用于合成LPS的鑒定

為了驗(yàn)證構(gòu)建的3 種克隆載體是否具有合成O-多糖的功能，將重組菌W3110/BAC-O157、W3110/BAC-50973、W3110/BAC-10110及其對(duì)照菌株用相應(yīng)的多糖抗血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7。與陰性對(duì)照菌W3110 相比，重組菌W3110/BAC-O157和W3110/BAC-50973有明顯的顏色反應(yīng)，表明重組菌利用大腸桿菌O157 型O-多糖和甲型副傷寒沙門(mén)菌O-多糖生成了LPS，而帶有銅綠假單胞桿菌O-多糖合成基因簇克隆載體的重組菌W3110/BAC-10110呈陰性。

2.4 多糖基因簇對(duì)菌毛蛋白PilE的修飾

圖2 外源多糖合成基因簇重組質(zhì)粒的PCR鑒定

圖3 多糖合成基因簇的SfiⅠ酶切鑒定

為了驗(yàn)證外源大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973、銅綠假單胞桿菌CMCC10110O-多糖是否可在糖基工程大腸桿菌中被寡糖轉(zhuǎn)移酶利用來(lái)修飾菌毛蛋白PilE，挑取重組菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL、CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-O157、CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-50973、CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-10110至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，16℃誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破菌取上清，用陽(yáng)離子柱初步純化，利用相應(yīng)的抗血清進(jìn)行Western 印跡檢測(cè)，結(jié)果如圖8。用抗O157 多抗進(jìn)行Western 印 跡，CLM24/pMMB66EHpilE-his/pETtac28-pglL/BAC-O157菌株在相對(duì)分子質(zhì)量40×103～58×103處出現(xiàn)特異條帶，而陰性對(duì)照菌株則未見(jiàn)其條帶?？梢?jiàn)，外源大腸桿菌O157型多糖在此系統(tǒng)中可被寡糖轉(zhuǎn)移酶PglL利用來(lái)修飾菌毛蛋白PilE。帶有甲型副傷寒沙門(mén)菌O-多糖合成基因簇克隆載體的糖基工程大腸桿菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-50973和帶有銅綠假單胞桿菌O-多糖合成基因簇克隆載體的糖基工程大腸桿菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-10110無(wú)特異性條帶，說(shuō)明菌毛蛋白PilE未被相應(yīng)的O-多糖修飾。

圖4 銅綠假單胞菌CMCC10110 LPS的15% SDS-PAGE銀染檢測(cè)

圖5 苯酚硫酸法測(cè)定葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖6 小鼠免疫血清抗LPS的IgG幾何平均滴度

3 討論

相比于一些醫(yī)療預(yù)防措施，疫苗更能提高及改善人類(lèi)的生存狀況。減毒活疫苗具有毒力，存在毒力恢復(fù)的危險(xiǎn)，因此不能應(yīng)用于免疫抑制的個(gè)體；滅活疫苗廉價(jià)，但副反應(yīng)大。因此，合格的疫苗應(yīng)具有持久的保護(hù)性免疫能力及最小的副作用。多糖-蛋白結(jié)合疫苗恰恰具有上述優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)的多糖結(jié)合疫苗利用化學(xué)交聯(lián)法制備，耗時(shí)、產(chǎn)量低、產(chǎn)物不均一、難純化，且疫苗批次間存在差異。本課題組前期開(kāi)展了大腸桿菌O-糖基化修飾系統(tǒng)研究，利用一步生物交聯(lián)法克服化學(xué)交聯(lián)法的不足。該技術(shù)相對(duì)于化學(xué)交聯(lián)法的優(yōu)勢(shì)在于，外源多糖和被糖基化的蛋白質(zhì)可以方便地被“替換”。

圖7 ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)入多糖合成基因簇的W3110菌外源多糖的表達(dá)

圖8 O157多糖對(duì)目的蛋白修飾鑒定

以F因子為基礎(chǔ)的BAC 作為載體在許多方面有一定的優(yōu)勢(shì)[20,23]。BAC 可以容納片段較大的外源DNA，且以BAC 為載體的克隆連續(xù)傳代培養(yǎng)至100代時(shí)，其插入片段在大腸桿菌中依然具有遺傳穩(wěn)定性[24-25]。在本研究中，我們以BAC 作為表達(dá)載體骨架，克隆了大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50973 的O-多糖合成基因簇克隆載體。將上述載體轉(zhuǎn)移至大腸桿菌K12 系列W3110 宿主菌中，可以檢測(cè)到多糖合成基因簇在W3110 中發(fā)揮了作用，并獲得了被O157 型O-多糖修飾的菌毛蛋白PilE。然而，將BAC-50973轉(zhuǎn)至糖基工程大腸桿菌中后卻無(wú)特異性條帶，表明菌毛蛋白PilE 未被相應(yīng)的O-多糖修飾，初步推斷宿主菌導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白糖基化效率低或多糖基因簇克隆載體轉(zhuǎn)化效率低，具體原因須進(jìn)一步探究。ELISA 結(jié)果顯示，銅綠假單胞桿菌O-多糖合成基因簇克隆載體的重組菌W3110/BAC-10110呈陰性，初步推斷，原因可能為：①因未知其血清型而自制血清，雖然利用間接ELISA 法測(cè)定了其血清的幾何平均滴度，但未經(jīng)純化，有可能利用度不高；②用PCR 方法克隆銅綠假單胞桿菌CMCC10110O-多糖合成基因簇，雖后期對(duì)該基因簇5'及3'兩端進(jìn)行了測(cè)序，但并未對(duì)基因簇整體進(jìn)行測(cè)序，因此PCR 過(guò)程中該O-多糖合成基因簇內(nèi)部可能發(fā)生了基因突變，從而導(dǎo)致陰性結(jié)果。具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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