高強(qiáng)度聚焦超聲治療對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

付志豪，武 倫，喬正榮，周世驥，李生偉*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 1.肝膽外科； 2.胃腸外科， 重慶 400010；3.重慶市第五人民醫(yī)院 普外科， 重慶 400062)

研究論文

高強(qiáng)度聚焦超聲治療對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

付志豪1，武 倫1，喬正榮3，周世驥2，李生偉1*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 1.肝膽外科； 2.胃腸外科， 重慶 400010；3.重慶市第五人民醫(yī)院 普外科， 重慶 400062)

目的探討高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)治療后的殘余肝癌組織中低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、P53和凋亡的變化及關(guān)系。方法建立肝癌HpG2細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型30只，采用CZF-Ⅱ型HIFU治療儀治療,隨機(jī)分為對(duì)照組、治療后1、3及5 d和1及2周組。HE染色觀察標(biāo)本病理變化；TUNEL法檢測(cè)殘余癌組織凋亡及計(jì)算凋亡指數(shù)；免疫組化、Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、P53蛋白和mRNA水平。結(jié)果治療后有殘余腫瘤細(xì)胞和大片壞死區(qū)域。與其他組相比，凋亡指數(shù)在3 d組顯著升高(Plt;0.05)，在5 d、1和2周組逐漸下降。HIF-1α和P53蛋白在各組中出現(xiàn)強(qiáng)弱不同的表達(dá)。HIF-1α和P53蛋白和mRNA在治療后1～3 d表達(dá)逐漸升高，在3 d組顯著高于其他組(Plt;0.05)，在5 d、1和2周組逐漸下降。結(jié)論HIFU治療肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤后可以促進(jìn)殘余癌細(xì)胞凋亡，此可能與HIF-1α、P53基因表達(dá)異常關(guān)系密切。

肝癌;低氧誘導(dǎo)因子;凋亡;高強(qiáng)度聚焦超聲

肝癌(hepatocellular carcinoma)是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)切除一直是首要的治療手段。但由于肝癌的早期癥狀與體征不明確，致使大多患者在確診時(shí)就已錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。高強(qiáng)度聚焦超聲(high-intensity focused ultrasoun-d,HIFU)是一種對(duì)實(shí)體腫瘤進(jìn)行非侵入性治療的局部治療手段[1]，為中晚期肝癌的治療提供了契機(jī)。但是HIFU治療后殘余腫瘤組織是影響療效的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，HIFU治療對(duì)腫瘤的微血管產(chǎn)生損害，導(dǎo)致殘余癌組織微環(huán)境低氧[2]。低氧會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列因子，其中最重要的是HIF-1α。同時(shí)低氧也可以誘導(dǎo)的P53表達(dá)增多，而P53是細(xì)胞凋亡最主要因子之一[3]。本研究通過(guò)建立人肝癌裸鼠移植模型，觀察HIFU治療后殘余癌組織中細(xì)胞凋亡與HIF-1α、P53的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)，裸鼠30只，6 ～8周齡，雌雄不限，體質(zhì)量18 ～20 g[重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK(渝)2012-0001 ]，混合飼料，隔籠喂養(yǎng)。

鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、P53(Abcam公司)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，免疫組化試劑盒(中衫金橋公司)，RT reagent Kit(Takara公司)，RNA抽提試劑盒(Omega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立、分組及治療方式：30只裸鼠, 用0.25%胰蛋白酶消化呈單個(gè)的人肝癌細(xì)胞HpG2(由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×107/mL，在裸鼠右側(cè)前頸部皮下接種細(xì)胞懸液0.1 mL。待裸鼠皮下移植瘤直徑約0.5 ～1.0c m時(shí)，使用CZF-Ⅱ型超聲治療儀，輸入治療參數(shù)(探頭頻率8.6 MHz，脈沖1 000 Hz，功率5 W)，治療時(shí)間為30 s。非治療組不給于任何處理。對(duì)照組、HIFU治療后1、3及5 d和1及2周各取5只裸鼠頸椎脫臼法處死，收集標(biāo)本。

1.3.2 HE染色觀察各組腫瘤組織的病理變化：處死裸鼠后，標(biāo)本使用4%多聚甲醛固定24 h后，給予常規(guī)脫水，透明浸蠟和包埋。石蠟切片，厚約4 μm，每組標(biāo)本取5片HE染色，光鏡下觀察。

1.3.3 缺口末端核苷標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡及計(jì)算凋亡指數(shù)：取出各組標(biāo)本，具體步驟按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):顯微鏡下腫瘤細(xì)胞系顯色棕黃色顆粒為陽(yáng)性，每組隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)各組腫瘤組織中的HIF-1α和P53蛋白變化：取出各組標(biāo)本，采用免疫組化SP法檢測(cè)各組HIF-1α、P53蛋白表達(dá)情況。具體步驟按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下，胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)各組腫瘤組織中的HIF-1α和P53蛋白含量：取出各組標(biāo)本，提取組織蛋白、制備SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、洗滌等過(guò)程，然后顯影，分析結(jié)果。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組基因HIF-1αmRNA和P53 mRNA的表達(dá)。將組織磨碎，提取無(wú)RNase的水溶解RNA，RNA定量。反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min；隨后95 ℃ 10 s，退火溫度15 s，72 ℃ 延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。上游引物5′-AAACCTAAATGTTCTGCCTAC-3′，下游引物5′-GGATGTTAATAGCGACAAAGT-3′。P53:上游引物5′-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′，下游引物 5′-TGGTACAGTCAGAGCCAACCT-3′。采用ΔΔCT法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)含量。

（1）讓學(xué)生改變角色，想象自己是孟母。（2）小組討論：孟母在這樣的環(huán)境，看到孟子的表現(xiàn)，她有什么感受？有何打算？

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 移植瘤HIFU治療后的肉眼改變。

與對(duì)照組相比，1 d組標(biāo)本的消融區(qū)域可見(jiàn)到成灰白色的凝固性壞死，周?chē)嬖跉堄嗄[瘤組織。在消融后3及5 d和1及2周組的標(biāo)本可見(jiàn)靶向區(qū)存在陳舊性壞死 (圖1)。

2.2 光鏡下HIFU治療后移植瘤的病理變化

與對(duì)照組相比,在1 d組的消融區(qū)出現(xiàn)大量壞死，在空白區(qū)域之間有殘留腫瘤細(xì)胞。在3 d組的消融靶區(qū)邊緣可見(jiàn)少量小血管和正常的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)纖維組織增生，逐漸將壞死區(qū)域包裹。在5 d和1及2周組中殘余腫瘤細(xì)胞也在逐漸增生(圖2)。

2.3 在光鏡下TUNEL檢測(cè)殘余腫瘤的凋亡結(jié)果

在各組觀察的細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)細(xì)胞系呈棕黃色顆粒的凋亡細(xì)胞(圖3)。與對(duì)照組相比，在1 d組凋亡指數(shù)出現(xiàn)升高(Plt;0.05)。在3 d組達(dá)到高峰，在5 d和1及2周組凋亡指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖4)。

2.4免疫組化檢測(cè)HIF-1α、P53蛋白在各組的表達(dá)

在顯微鏡下，HIF-1α蛋白的表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，P53蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞系出現(xiàn)棕黃色顆粒。在對(duì)照組，可見(jiàn)胞質(zhì)或胞核染色淺，數(shù)量也較少。消融后胞質(zhì)或胞核染色逐漸加深，而且數(shù)量也逐漸增加(圖5)。

A.control group；B.1 day group圖1 HIFU治療后的移植瘤變化Fig 1 The changes of xenograft after treatment by HIFU

A.contol group；B.1 day group；C.1 week group圖2 不同組腫瘤的形態(tài)學(xué)改變Fig 2 Changes of morphology on tumorous tissues in different groups(HE ×200)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with other groups圖4 凋亡指數(shù)在各組情況Fig 4 Apoptosis index in different groups

2.5Westernblot檢測(cè)HIF-1α和P53蛋白在各組的表達(dá)

治療后HIF-1α和P53蛋白表達(dá)逐漸升高，在3 d組達(dá)到高峰(Plt;0.05)。在5 d和1及2周組HIF-1α和P53蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降(圖6)。

2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、P53mRNA水平

治療后HIF-1α和P53 mRNA水平逐漸升高，在3 d組達(dá)到高峰(Plt;0.01)。在5 d和1及2周組HIF-1α和P53 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降(圖7)。

3 討論

HIFU是中晚期癌癥的一種安全易行的局部非侵入治療方法[4]，已在部分良惡腫瘤中廣泛應(yīng)用[5]，但在肝癌治療時(shí)由于肋骨遮擋、熱沉積效應(yīng)、呼吸運(yùn)動(dòng)和定位方式存在治療盲區(qū)等因素，引起殘癌細(xì)胞的存在，而后者正成為影響HIFU治療肝癌效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。因此，弄清殘癌細(xì)胞的凋亡規(guī)律可能為盡可能的殺傷殘癌組織、提高HIFU治療效果而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIFU治療肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤后，第1天腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，3 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后下降，2周時(shí)凋亡指數(shù)回到基線水平。此與HIFU消融兔肝后消融區(qū)域周?chē)霈F(xiàn)的細(xì)胞凋亡變化規(guī)律相一致[7]。由此可見(jiàn)HIFU治療肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤后可以促進(jìn)殘余癌細(xì)胞凋亡，其效應(yīng)的時(shí)間窗為2周。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)HIFU治療后殘余腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在治療后1 d顯著升高，在3 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后下降。研究表明HIFU治療腫瘤時(shí)可以對(duì)腫瘤的微細(xì)血管造成嚴(yán)重?fù)p傷，從而導(dǎo)致殘余腫瘤組織的微環(huán)境低氧[2]。低氧可以引起HIF-1α的表達(dá)和聚集，它通過(guò)促進(jìn)紅細(xì)胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代謝，細(xì)胞存活，凋亡等生物學(xué)效應(yīng)使機(jī)體、 組織、細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境[8-9]。此可能部分解釋了HIFU治療早期殘癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào)。而另一方面已證實(shí)HIF-1α主要在氧濃度0%～2%之間穩(wěn)定聚集[10]，隨著消融時(shí)間的延長(zhǎng)，血管新生和單個(gè)殘癌細(xì)胞微環(huán)境氧含量的增多，HIF-1α?xí)谎杆俳到?。本?shí)驗(yàn)亦觀察到HIF-1α表達(dá)達(dá)峰后隨著HIFU治療時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)下調(diào)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)與殘癌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化的時(shí)間點(diǎn)規(guī)律一致。關(guān)于HIFU治療后HIF-1α與殘癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，既往研究表明P53在低氧微環(huán)境時(shí)表達(dá)，而表達(dá)穩(wěn)定性與HIF-1α相關(guān)[11～12]。HIF-1α可以通過(guò)與MDM2結(jié)合，促進(jìn)P53基因的穩(wěn)定從而促進(jìn)低氧區(qū)域細(xì)胞凋亡[13]。因此本研究進(jìn)一步觀察了P53在殘余腫瘤組織中表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P53與HIF-1α和凋亡指數(shù)出現(xiàn)顯著升高的時(shí)間點(diǎn)基本一致。推測(cè)HIFU治療引起肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的殘癌細(xì)胞凋亡作用可能與HIF-1α、P53基因表達(dá)異常關(guān)系密切，確切的信號(hào)通路機(jī)制本實(shí)驗(yàn)課題組正在探討中。總之，HIFU治療肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤后可誘導(dǎo)殘余癌細(xì)胞凋亡，此效應(yīng)可能與HIF-1α、P53基因表達(dá)異常關(guān)系密切;調(diào)控HIF-1α基因的表達(dá)有望成為HIFU治療后殘余癌組織靶向殺傷作用的潛在靶點(diǎn)，這為增強(qiáng)HIFU治療效果提供了新方法。

A.control group(weak) ； B.1 day group(moderate) ；C.3 days group(strong); D.control group (weak) ； E.1 day group(moderate) ；F.3 days group(strong)

圖5免疫組化檢測(cè)HIF-1α、P53蛋白表達(dá)的情況
Fig5ExpressionofHIF-1α,P53intumoroustissuesofdifferentgroups(Immunohistochemistry×400)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.05 compared with other groups圖6 HIF-1α和P53蛋白在各組腫瘤組織中的表達(dá)Fig 6 Expression of HIF-1α,P53 in tumorous tissues of different groups detected by Western blot(±s,n=5)

*Plt;0.05 compared with control group； #Plt;0.01 compared with other groups圖7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)HIF-1α、P53 mRNA在各組中的表達(dá)

[1] Shen HP, Gong JP, Zuo GQ. Role of high-intensity focused ultrasound in treatment of hepatocellular carcinoma[J].Am Surg, 2011,77:1496-1501.

[2] Chen LP, Li N, Ye H.The Effect of high intensity focused ultrasound on vascular endothelial growth factor and microvessel density in rabbit V-X2 hepatocellular carcinoma models[J]. Hepatogastroenterology,2012,12;60.

[3] Weinmann M, Jendrossek V, Handrick R,etal.Molecular ordering of hypoxia-induced apoptosis: critical involvement of the mitochondrial death pathway in a FADD/caspase-8 independent manner[J].Oncogene,2004,6;23:3757-3769.

[4] Cheung TT, Fan ST, Chan SC,etal. High-intensity focused ultrasound ablation: An effective bridging therapy for hepatocellular carcinoma patients[J]. World J Gastroenterol,2013,28;19: 3083-3089.

[5] AL-Bataineh O, Jenne J, Huber P.Clinical and future applications of high intensity focused ultrasound in cancer[J].Cancer Treat Rev, 2012,38:346-353

[6] Rijkhorst EJ, Rivens I, Haar Gt,etal.Effects of respiratory liver motion on heating for gated and model-based motion-compensated high-intensity focused ultrasound ablation[J]. Med Image Comput Comput Assist Interv,2011;14(Pt 1):605-612.

[7] Luo W, Zhou X, Gong X,etal. Study of sequential histopathologic changes, apoptosis, and cell proliferation in rabbit livers after high-intensity focused ultrasound ablation[J].J Ultrasound Med,2007,26:477-485.

[8] Keith B, Johnson RS, Simon MC. HIF-1α and HIF2α: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression[J]. Nat Rev Cancer,2011,15;12:9-22.

[9] Majmundar AJ, Wong WJ, Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40:294-309.

[10] Holmquist-Mengelbier L, Fredlund E, L?fstedt T,etal.Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype[J].Cancer Cell,2006,10:413-423.

[11] Pan Y, Oprysko PR, Asham AM,etal.P53 cannot be induced by hypoxia alone but responds to the hypoxic microenvironment[J].Oncogene,2004,23:4975-4983.

[12] An WG, Kanekal M, Simon MC,etal.Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1alpha[J].Nature,1998,392:405-408.

[13] Chen D, Li M, Luo J,etal.Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function[J].J Biol Chem,2003,278:13595-13598.

Effect of HIFU on hypoxia-inducible factor (HIF-1α)expression and cell apoptosis in liver cancer cell xenografts of nude mice

FU Zhi-hao1, WU Lun1, QIAO Zheng-rong3, ZHOU Shi-ji2, LI Sheng-wei1*

(1.Dept. of Hepatobiliary Surgery; 2.Dept. of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400010; 3.Dept. of General Surgery,People’s Five Hospital of Chongqing,Chongqing 400062,China)

ObjectiveTo study the effects of hypoxia-inducible factor (HIF-1α) on apoptosis of the residual tumor cells in nude mice after treatment by high-intensity focused ultrasound (HIFU).MethodsHuman HCC implantation was established in 30 nude mice. CZF-Ⅱ HIFU therapeutic apparatus was used for treatment.Nude mice were randomly divided into control group and treatment group (included 1 d group, 3 d group, 5 d group, 1 week group,and 2 weeks group). Pathological changes were observed with HE staining;Cell apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated Dutp nick end-labeling (TUNEL) assay; SP immunohistochemistry was used to detect HIF-1α protein;Western blot and real-time quantitative PCR were used to detect HIF-1α, P53 protein and mRNA expression levels.ResultsHE showed that there were residual tumor cells and large necrotic areas after treatment. Compared with other groups, the apoptosis index

in 3 d group was significantly higher (Plt;0.05), while in the 5 d group,1 week group,2 weeks group gradually decreased. Immunohistochemistry showed that the expression of HIF-1α, P53 protein was different in each group. Compared with other groups,Western blot and RT-PCR showed an increase of HIF-1α, P53 protein and mRNA levels in groups after treatment of 1 to 3 days, and peaked in 3 d group(Plt;0.05).ConclusionsHIFU treatment can induce consistent apoptosis in residual tumor, which may be related with disordered expression of HIF-1α and P53.

liver neoplasms; hypoxia-inducible factor; apoptosis; high-intensity focused ultrasound

2013-06-21

2014-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81301975,81272570);重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)資助項(xiàng)目(渝衛(wèi)2012-1-040,渝衛(wèi)2010-1-68)

*通信作者(correspondingauthor)：lswgg@126.com

1001-6325(2014)05-0648-06

R 735.7

A