Orai2參與了HUVEC外鈣敏感受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和NO生成

王臘梅，鐘 華，趙 慧，王 靜，龐麗娟，孫志萍，何 芳*

(新疆石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.病理生理教研室；3.病理教研室； 4.醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心；新疆 石河子 832002)

研究論文

Orai2參與了HUVEC外鈣敏感受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和NO生成

王臘梅1,2，鐘 華1,2，趙 慧1,2，王 靜1,2，龐麗娟1,3，孫志萍1,4，何 芳1,2*

(新疆石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.病理生理教研室；3.病理教研室； 4.醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心；新疆 石河子 832002)

目的研究鈣釋放激活的鈣調(diào)素2(Orai2)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞外鈣敏感受體(CaR)介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和一氧化氮(NO)生成中的作用。方法1)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的Orai2干擾質(zhì)粒(Orai2shRNA)轉(zhuǎn)染入HUVEC，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)Orai2 mRNA和蛋白的表達(dá)。2)取2～5代HUVEC，分別以精胺激活CaR(鈣池操縱性鈣通道(SOC)和受體操縱性鈣通道(ROC)均激活)、ROC模擬劑12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231(激活ROC及阻斷SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑Ro31-8220、經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967(阻斷ROC及激活SOC)為細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為3組：特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Orai2shRNA組)，未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)，空質(zhì)粒組(vehicle組)，用熒光探針Fura-2/AM、DAF-FM負(fù)載方法同步檢測(cè)[Ca2+]i和NO的生成。結(jié)果1)與control組相比，shOrai2-71干擾后，Orai2 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低，抑制率分別為75.75%和70.58%(Plt;0.05)。2)與對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比，在4種不同處理因素作用下，Orai2shRNA轉(zhuǎn)染組[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值均明顯降低(Plt;0.05)。結(jié)論Orai2參與了HUVEC中CaR經(jīng)SOC和ROC激活介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和NO生成。

Orai2；一氧化氮；鈣離子；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

隨著鈣通道相關(guān)蛋白C-型瞬時(shí)型感受器電位通道 (canonical transient receptor potential channels，TRPCs)、基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecules，STIMs)、鈣釋放激活的鈣調(diào)素(calcium release-activated calcium modulator，Orais)的發(fā)現(xiàn)，其單個(gè)組件或復(fù)合物在不同組織細(xì)胞介導(dǎo)的生理和病理生理過(guò)程中作用已被進(jìn)一步研究。Orai家族是鈣池操縱性鈣通道(store-operates cation channels, SOC)的構(gòu)成蛋白，包括Orai1、Orai2和Orai3[1]。其中，Orai1可以同Orai2，Orai3，甚至可能與TRPCs形成同源/異源復(fù)合體介導(dǎo)鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流(store operated calcium entry，SOCE)或調(diào)節(jié)受體操縱鈣內(nèi)流(receptor-operated calcium entry, ROCE)[2]，而由Orai2構(gòu)成的SOCE或ROCE在不同組織細(xì)胞中生物學(xué)作用報(bào)道甚少。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)中，鈣敏感受體(Ca-sensing receptor, CaR)激活介導(dǎo)了[Ca2+]i升高及一氧化氮(nitric oxide, NO)的生成過(guò)程[3-4]，SOC和受體操縱性鈣通道(receptor-operated channels, ROC)以協(xié)同的方式參與了此過(guò)程，且TRPC1、STIM1和Orai1為上述過(guò)程的關(guān)鍵組件之一。本研究觀察Orai2基因沉默后對(duì)HUVEC中[Ca2+]i和NO生成影響，揭示Orai2在CaR介導(dǎo)[Ca2+]i和NO生成中作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)和個(gè)人知情同意)。

ECM培養(yǎng)基(Sciencell公司)；蛋白酶抑制劑(Calbichem公司)；兔抗人Orai2多克隆抗體、鼠抗β-Actin單克隆抗體(Santa Cruze公司)；二抗(Protein Tech公司)；ECL發(fā)光試劑盒(Thermo公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與Real time RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；LipofectamineTM2000與Opti-MEM(Invitrogen公司)；Fura-2/AM(Invitrogen公司)；DAF-FM DA(NO熒光探針)(Beyotime公司)；G418 (Biosharp公司)、去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega公司)；shRNA(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；引物(友名生物技術(shù)有限公司)；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)與鑒定：按本實(shí)驗(yàn)室以前的方法培養(yǎng)HUVEC 并傳代[3]，用細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定HUVEC，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Orai2基因的shRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:1)按shRNA的設(shè)計(jì)原則，GenBan中人Orai2的cDNA序列(NM-032831)，以其同源的編碼DNA序列部分設(shè)計(jì)、合成3條shRNA，分別命名為shOrai2-71、shOrai2-72和shOrai2-73，上述序列經(jīng)BLAST軟件分析，與人類基因外顯子無(wú)同源性，排除對(duì)其他基因非特異性干擾，并與載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒。2)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞增殖至80%匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組即空白對(duì)照組(control組)、空質(zhì)粒組(vehicle組)和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實(shí)驗(yàn)組(Orai2shRNA)。以6孔板的一個(gè)孔為例，首先取一無(wú)菌離心管加250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基和5 μL LipofectamineTM2000(Invitrogen)，輕輕混勻。取另一無(wú)菌離心管加250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基和2 μg個(gè)質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。室溫下孵育5 min后，混勻以上2種復(fù)合物，室溫孵育20 min。最后將此復(fù)合物加入到含有1.5 mL OPTI-MEM的6孔板中，37 ℃培養(yǎng)4～6 h后換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，孵育24～48 h后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理：選取干擾效率最高的shOrai2-71為實(shí)驗(yàn)組，其余兩組分別為未轉(zhuǎn)染組即空白對(duì)照組(control組)與空質(zhì)粒組(vehicle組)。將3組細(xì)胞接種于圓形玻片上，待HUVEC細(xì)胞增殖匯合至80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別與含精胺(2 mmol/L)+Ca2+(2 mmol/L)、含精胺(2 mmol/L)+Ca2+(2 mmol/L)+CaR的抑制劑Calhex231(1 μmol/L)+ROC模擬劑TPA(20 μmol/L)、含精胺(2 mmol/L)+Ca2+(2 mmol/L)+PKC抑制劑Ro31-8220(200 nmol/L)或+PKCs、PKCμ抑制劑Go6967(200 nmol/L)的ECM孵育20 min，將玻片取出放入灌流槽中測(cè)定加精胺刺激后[Ca2+]i△ratio值和NO熒光強(qiáng)度值的變化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Real time RT-PCR檢測(cè)HUVEC中Orai2 mRNA的表達(dá)：按SYBR greenⅠRt-PCR試劑盒說(shuō)明書操作。Orai2的上游引物：5′-GGTGTAGTGGGAGG TGAGGA-3′，下游引物：5′-TGGCTTTACCACCATGTC AA-3′。β-actin的上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATC ACTATCG-3′，下游引物：5′-GGCATAGAGGTCTTT ACGGATG-3′。用Trizol法抽提細(xì)胞RNA，紫外分光光度儀分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)計(jì)算提取的總RNA濃度及純度。取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板以β-actin作為內(nèi)參照進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，其中SYBR Premix Ex Tap12.5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，樣品cDNA 2.0 μL，滅菌蒸餾水9.5 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，30 s；PCR反應(yīng)(95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s)，40個(gè)循環(huán)。隨之由電腦自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)HUVEC中Orai2的蛋白表達(dá)及干擾效率：各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后，用G418進(jìn)行穩(wěn)篩，預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，冰上加入含3 μL蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液300 μL，刮下細(xì)胞收集于離心管中。冰上靜置60 min，12 000r/min，離心15 min。取上清液棄沉淀。取5 μL上清液測(cè)蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)化。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗Orai2抗體，抗β-actin抗體置于4 ℃過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒處理，顯影、定影，重復(fù)3次。

1.2.6 HUVEC中Ca2+濃度測(cè)定：參照文獻(xiàn)[5]測(cè)定HUVEC中Ca2+水平。通過(guò)鈣熒光成像系統(tǒng)IPA software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 HUVEC中NO含量的檢測(cè)：參照文獻(xiàn)[5]測(cè)定HUVEC中NO含量。通過(guò)鈣熒光成像系統(tǒng)IPA software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 shRNA成功轉(zhuǎn)染HUVEC

細(xì)胞轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的shOrai2后，鏡下可見成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)發(fā)出可反映轉(zhuǎn)染效率的綠色熒光。轉(zhuǎn)染48 h后加入G418穩(wěn)篩后，可獲取90%以上的陽(yáng)性克隆細(xì)胞(圖1)。

2.2 Orai2 mRNA的表達(dá)及干擾效率

轉(zhuǎn)染各組與control組相比，可見vehicle組mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，其余各轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)均有降低(n=4，Plt;0.05)，尤其是shOrai2-71組中Orai2 mRNA表達(dá)顯著降低(抑制率為75.75%)(圖2)。

2.3 Orai2的蛋白表達(dá)及干擾效率

轉(zhuǎn)染各組與control組相比，可見vehicle組的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，其余各轉(zhuǎn)染組蛋白的表達(dá)均有降低(n=3，Plt;0.05)，尤其是shOrai2-71組中Orai2的蛋白表達(dá)顯著降低(抑制率為70.58%)(圖3)。

2.4不同處理因素對(duì)HUVEC中[Ca2+]i和NO生成的影響

2.4.1Orai2基因沉默使精胺介導(dǎo)的HUVEC中[Ca2+]i和NO生成減少：與control組及vehicle組相比，實(shí)驗(yàn)組[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(n=3，Plt;0.05)，vehicle組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無(wú)顯著差異(圖4)。

A.confocal microscopy showed the HUVEC profile in nature light; B.confocal microscopy showed FITC-labelled green fluorescence in HUVEC; C.merged image of A,B (scale bar=50 μm)

圖1化學(xué)熒光FITC標(biāo)記的shOrai2轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞
Fig1FITC-labelledshOrai2transfectedHUVEC(×20)

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle group圖2 HUVEC中轉(zhuǎn)染組Orai2 mRNA的干擾效率Fig 2 Interference ratio of Oraiz mRNA and inhibition ratio after transfection in HUVEC(±s, n=4)

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle group圖3 各轉(zhuǎn)染組HUVEC中Orai2蛋白的表達(dá)及抑制效率Fig 3 Expression of Orai2 protein examined by Western blot and inhibition ratio in HUVEC(±s, n=3)

2.4.2Orai2基因沉默使TPA+Calhex231介導(dǎo)的HUVEC中[Ca2+]i和NO生成減少：與control組及vehicle組相比，實(shí)驗(yàn)組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(n=3，Plt;0.05)，vehicle組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無(wú)顯著差異 (圖5)。

2.4.3Orai2基因沉默使Ro31-8220介導(dǎo)的HUVEC中[Ca2+]i和NO生成減少：與control組及vehicle組相比，實(shí)驗(yàn)組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(n=3，Plt;0.05)，vehicle組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無(wú)顯著差異 (圖6)。

2.4.4Orai2基因沉默使Go6967介導(dǎo)的HUVEC中[Ca2+]i和NO生成減少：與control組及vehicle組相比，實(shí)驗(yàn)組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(n=3，Plt;0.05)，vehicle組中[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無(wú)顯著差異 (圖7)。

3 討論

本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在HUVEC中CaR激活引發(fā)持續(xù)Ca2+內(nèi)流是NO生成的重要條件，但參與Ca2+內(nèi)流關(guān)鍵分子組件尚不清楚。應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與SOC功能密切相關(guān)的通道蛋白：STIM1和Orai1。Orai1的同源蛋白Orai2和Orai3也參與構(gòu)成SOC，但是這些通道具有與Orai1構(gòu)成的通道不完全一致的生物物理特性[6]。在異源表達(dá)STIM1、Orai1、Orai2和Orai3的HEK293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，所有Orai蛋白都能增加SOCE，且增強(qiáng)SOC的作用功效依次是Orai1gt;Orai2gt;Orai3，其中Orai3能部分代償Orai1敲除對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響[7]。對(duì)Orai2的研究表明其特點(diǎn)與Orai1相似，Orai2單獨(dú)表達(dá)時(shí)抑制HEK293細(xì)胞形成SOCE；當(dāng)同STIM1聯(lián)合表達(dá)時(shí)，則可以增強(qiáng)SOCE。

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle-Orai2 group圖4 CaR激動(dòng)劑精胺刺激HUVEC后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+和NO熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle-Orai2 group圖5 ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231刺激HUVEC后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+和NO熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle-Orai2 group圖6 PKC抑制劑Ro31-8220刺激HUVEC后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+和NO熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化

*Plt;0.05 compared with control group; #Plt;0.05 compared with vehicle-Orai2 group圖7 經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967刺激HUVEC后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+和NO熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化

HUVEC中CaR為功能性表達(dá)，其在介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流、eNOS活性和NO生成中起著重要作用[8]，且SOC與ROC是以協(xié)同方式參與CaR介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流及NO生成。而鈣通道相關(guān)蛋白Orai2是否為其關(guān)鍵分子組件尚不清楚。研究首先采用脂質(zhì)體法將設(shè)計(jì)好的shRNA轉(zhuǎn)染到HUVEC中，將抑制效率最高的shRNA轉(zhuǎn)染HUVEC，在保證沉默Orai2基因有效抑制Orai2表達(dá)前提下，以精胺與原代培養(yǎng)HUVEC共孵育激活CaR為細(xì)胞模型，證實(shí)了在HUVEC中沉默Orai2后對(duì)CaR介導(dǎo)的[Ca2+]i升高和NO生成均有抑制作用，此抑制效應(yīng)由shRNA特異抑制Orai2基因表達(dá)所介導(dǎo)。而后又以ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231、PKC抑制劑Ro31-8220，經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967共孵育HUVEC為細(xì)胞模型，通過(guò)分別激活SOC或ROC最終證明在精胺刺激激活CaR介導(dǎo)[Ca2+]i和NO的生成過(guò)程中，Orai2既作為SOC的關(guān)鍵組件，又作為ROC的關(guān)鍵組件參與了CaR介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流及NO生成。

綜上所述，本研究證明了Orai2為CaR經(jīng)SOC及ROC途徑介導(dǎo)鈣內(nèi)流和NO生成的關(guān)鍵組件之一。這不僅從SOC及ROC角度揭示了CaR在血管內(nèi)皮細(xì)胞中部分功能及作用機(jī)制，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了參與上述過(guò)程的關(guān)鍵分子組件。本研究將有助于以鈣信號(hào)系統(tǒng)障礙的多病理機(jī)制為靶點(diǎn)，為心腦血管疾病防治提供一條新思路。

志謝：衷心感謝華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系/衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)指導(dǎo)。

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Orai2 participates in CaR mediated Ca2+entryand NO generation in human umbilical vein endothelial cells

WANG La-mei1,2, ZHONG Hua1,2, ZHAO Hui1,2, WANG Jing1,2, PANG Li-juan1,3,SUN Zhi-ping1,4, HE Fang1,2*

(1.Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education; 2.Dept. of Pathophysiology;3.Dept. of Physiology; 4.Centre of Medical Functional Experiments, Medical College of Shihezi University, Shihezi 832002, China)

ObjectiveTo study the role of calcium release-activated calcium modulator 2(Orai2) in extracellular Ca2+-sensing receptor (CaR)-induced extracellular Ca2+influx and the production of nitric oxide (NO) in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).Methods1) We silenced the expression of Orai2 genes in HUVEC by transfection constructed Orai2 RNA interference plasmids. The expression of Orai2 protein and mRNA levels were determined by Western blotting and real time RT-PCR respectively. 2) The second to fifth passage of HUVEC were

incubated with CaR agonist spermine(activating store-operates cation channels (SOC) and examined for receptor-operated channels (ROC)), CaR negative allosteric modulator Calhex231 and ROC analogue TPA , protein kinase C (PKC) inhibitor Ro31-8220, PKCs and PKCμ inhibitor Go6967.Those cell models were divided into three groups: Orai2-71 short hairpin RNA group (Orai2shRNA); control group and vehicle group. Intracellular Ca2+concentration was detected and the production of NO was determined by DAF-FM.Results1)shRNA targeted at the Orai2 genes decreased Orai2 protein and mRNA levels by 70.58% and 75.75% respectively (Plt;0.05). (2)[Ca2+]iratio and the net NO fluorescence intensity values of Orai2shRNA group in four different treatments were significantly reduced (Plt;0.05).ConclusionsOrai2 participates in CaR-mediated Ca2+influx and NO production through SOC and ROC activation in HUVEC.

Orai2; nitric oxide; Ca2+; human umbilical vein endothelial cells

2013-08-26

2013-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160239,81160018)

*通信作者(correspondingauthor)： fangf2002shz@126.com

1001-6325(2014)05-0595-07

R363

A