將人的皮膚成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞

賈偉麗，李 默，吳劍宇，王淑艷，陳志國，張 愚*

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 1.細(xì)胞生物室； 2.教育部神經(jīng)變性病重點實驗室， 北京 100053)

研究論文

將人的皮膚成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞

賈偉麗1,2，李 默1,2，吳劍宇1,2，王淑艷1,2，陳志國1,2，張 愚1,2*

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 1.細(xì)胞生物室； 2.教育部神經(jīng)變性病重點實驗室， 北京 100053)

目的探討將人的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞。方法將成人的皮膚成纖維細(xì)胞用帶有Pax6報告基因和綠色熒光蛋白的慢病毒感染，并經(jīng)歷其病毒載體的抗性基因嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞作為初始細(xì)胞，轉(zhuǎn)入在維持神經(jīng)干細(xì)胞生長發(fā)育、分化、保持功能穩(wěn)定性和可塑性中起非常重要作用的10個基因Sox2、Klf4、c-Myc、Tcf3、Ascl1、Brn2、Neurog2、Foxg1、Hes1和Id1，對經(jīng)過重新編程表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選，并對其進(jìn)行免疫熒光染色和分化的鑒定。結(jié)果轉(zhuǎn)入基因后成功誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞(iNSCs)。iNSCs能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志性基因(Nestin)，能分化為神經(jīng)元(β Ⅲ-tubulin)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)。結(jié)論通過轉(zhuǎn)入外源因子的方式可以將人的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞。

誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞；人的皮膚成纖維細(xì)胞；重編程；轉(zhuǎn)錄因子；報告基因

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是存在于胚胎或成體腦組織中的一種干細(xì)胞，可以自我更新，并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。

人源神經(jīng)干細(xì)胞 (human neural stem cells,hNSCs)主要來源于流產(chǎn)胎兒的腦組織，除來源不穩(wěn)定和供給受限制外，還面臨著將非自體的細(xì)胞進(jìn)行移植所引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)[1]和誘導(dǎo)神經(jīng)元(induced neurons,iNs)[2-6]的出現(xiàn)可以解決免疫排斥問題，但iPSCs分化后殘留細(xì)胞的致瘤性，iNs無法在移植后存活都限制了其的臨床應(yīng)用。本實驗運用轉(zhuǎn)入外源因子的方式將人的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(induced neural stem cells,iNSCs)，并對其進(jìn)行了NSCs的相關(guān)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblast)系GM00498(Coriell公司)，fibroblast的培養(yǎng)成分如下：高糖DMEM，15%胎牛血清，L-谷氨酸，青鏈霉素，非必須氨基酸。293T細(xì)胞的培養(yǎng)成分如下：高糖DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酸，青鏈霉素。NSCs培養(yǎng)成分如下：DMEM F12+N2+B27+胰島素+牛血清白蛋白+20 ng/mL bFGF(基本成纖維細(xì)胞生長因子)(Ramp;D公司)+20 ng/mL EGF(表皮生長因子)(Ramp;D公司)+20 ng/mL PDGFAB(細(xì)胞分裂因子)(Ramp;D公司)。NSCs分化培養(yǎng)成分：DMEM F12+N2+B27+胰島素+牛血清白蛋白。免疫熒光染色磷酸緩沖液成分：0.01 mol/L PBS+0.3% Triton X-100。抗體稀釋液成分： 1%驢血清+磷酸緩沖液。培養(yǎng)皿培養(yǎng)板(Falcon公司)，RNA提取試劑盒(Qiagen公司)，反反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)，DNA聚合酶(Takala公司)，EcoR1、T4連接酶(Biolabs公司)，Nestin、Olig2、Ki67、GFAP、β Ⅲ-tubulin(Millipore Bioscience公司)，BrdU(AbD Serotec公司)，DAPI(Sigma公司)，熒光二抗(Jackson公司)，超濾管(Beckman公司)，載體Tet-O-FUW-EGFP(Addgene公司)，細(xì)胞培養(yǎng)試劑除以上注明外(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fibroblast的培養(yǎng)和傳代： fibroblast接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用fibroblast培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2 帶報告基因的初始細(xì)胞的獲得: 用帶有Pax6報告基因和GFP的慢病毒去感染fibroblast,病毒是通過293T病毒包裝細(xì)胞產(chǎn)生，超濾管6 000×g超速離心1 h獲得，加聚凝胺(4 g/L)增加轉(zhuǎn)染效率，24 h后換fibroblast培養(yǎng)基，24 h后加入嘌呤霉素(50 μg/mL)篩選5 d。將其用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，按照20 000/mL濃度接種于6孔板中。

1.2.3 iNSCs的誘導(dǎo):從hNSCs提取RNA,以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，用預(yù)先設(shè)計的引物序列(表1)PCR得到目的片段。利用EcoR1內(nèi)切酶將Tet-ON-FUW-EGFP和目的片段雙酶切， T4連接酶連接，得到目的質(zhì)粒Tet-O-FUW-Sox2，Tet-O-FUW-Klf4，Tet-O-FUW-c-Myc，Tet-O-FUW-Tcf3，Tet-O-FUW-Ascl1，Tet-O-FUW-Brn2，Tet-O-FUW-Neurog2，Tet-O-FUW-Foxg1，Tet-O-FUW-Hes1，Tet-O-FUW-Id1。通過293T病毒包裝細(xì)胞產(chǎn)生病毒，超濾管6 000×g超速離心1 h獲得濃縮病毒。利用293T細(xì)胞進(jìn)行滴度測定，并將慢病毒分別感染293T細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR檢測，保證病毒工作。

表1 引物的序列Table 1 The sequence of primers

在fibroblast培養(yǎng)基中，加入以上10種慢病毒，聚凝胺(4 g/L)，按照MOI=10感染fibroblast，恢復(fù)24 h后換成fibroblast培養(yǎng)基，24 h后重新第2輪感染，24 h后換成fibroblast培養(yǎng)基，恢復(fù)24 h，之后使用NSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4 iNSCs的初步篩選：在病毒感染后14 d熒光顯微鏡下確認(rèn)綠色細(xì)胞后，用accutase細(xì)胞消化液對其進(jìn)行消化制作單細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選，陽性細(xì)胞繼續(xù)用NSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.5 iNSCs的鑒定和分化鑒定：分選的陽性細(xì)胞一部分進(jìn)行懸浮增殖的培養(yǎng)；一部分接種到24孔板中鋪有多聚賴氨酸+層黏連蛋白的玻璃片上。將玻璃片上的細(xì)胞一部分進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物和細(xì)胞增殖能力的鑒定；另一部分撤掉生長因子，用NSCs分化培養(yǎng)基使其向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。14 d后進(jìn)行神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的鑒定。

1.2.6 免疫熒光細(xì)胞染色：細(xì)胞4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，磷酸緩沖液洗3次，3%驢血清封閉1 h。稀釋濃度為：一抗1∶500，二抗1∶200。

iNSCs特異性標(biāo)志物的鑒定，采用一抗為小鼠抗人的Nestin，兔抗人的Olig2，熒光二抗分別為驢抗小鼠Fitc，驢抗兔Fitc。

iNSCs增殖能力的鑒定，采用的一抗為兔抗人的Ki67，大鼠抗人的BrdU，熒光二抗對應(yīng)分別為驢抗兔Cy-3，驢抗大鼠Cy-3。

iNSCs的分化鑒定，采用的一抗為兔抗人的GFAP和小鼠抗人的β Ⅲ-tubulin，熒光二抗分別用驢抗兔Cy-3，驢抗小鼠Fitc。

以上均于加一抗后4 ℃過夜，磷酸緩沖液洗3次，間隔5 min，加熒光二抗避光孵育2 h，磷酸緩沖液洗3次，間隔5 min， DAPI(1∶200)核染色，磷酸緩沖液洗3次，間隔5 min，封片劑封片，共聚焦顯微鏡觀察拍攝。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞聚集體的獲得

經(jīng)病毒誘導(dǎo)，熒光顯微鏡下確認(rèn)有綠色熒光蛋白表達(dá)后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選，形成懸浮的類似神經(jīng)干細(xì)胞的聚集體(圖1)。

A.images of fibroblast before infection； B.iNSCs in suspension cultures圖1 轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞為類似神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞Fig 1 Fibroblast could be induced to cells similar to NSCs by transcription factors(×100)

2.2 Pax6報告基因的應(yīng)用

Pax6為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志性基因，通過GFP的表達(dá)為流式細(xì)胞儀分選創(chuàng)造了條件，以此可以得到相對較純的iNSCs。

A.Nestin; B.Olig2; C.Ki67; D.BrdU圖2 神經(jīng)干細(xì)胞和增殖能力的鑒定Fig 2 The characterization and proliferation identification of NSCs

2.3神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的免疫熒光鑒定

將iNSCs進(jìn)行NSCs特異性標(biāo)志物的染色鑒定，免疫熒光染色顯示Nestin、Olig2均為陽性(圖2A，B)；其增殖能力的標(biāo)志物鑒定，免疫熒光染色顯示Ki67、BrdU均為陽性(圖2C，D)。定向分化的iNSCs進(jìn)行神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色鑒定，免疫熒光結(jié)果顯示神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β Ⅲ-tubulin，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP均為陽性(圖3)。

A.β Ⅲ-tubulin; B.GFAP圖3 神經(jīng)干細(xì)胞定向分化能力鑒定Fig 3 The directional differentiation potency identification of NSCs

免疫熒光染色證明誘導(dǎo)得到的細(xì)胞為具有自我增殖能力和向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的類似于NSCs的細(xì)胞。

3 討論

由于神經(jīng)細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞，所以很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復(fù)治療面臨很大的難題。比如帕金森病是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡；多發(fā)性硬化主要為膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷。而神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的移植為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療帶來了新的希望。出于倫理學(xué)和降低異體排斥引發(fā)的各類并發(fā)癥的考慮，自體神經(jīng)組織或細(xì)胞是最理想的移植來源，但iPSCs[1]分化后殘留細(xì)胞的致瘤性，iNs[2-6]無法在移植后存活都限制了其的臨床應(yīng)用。因此，將成體細(xì)胞直接誘導(dǎo)為NSCs為細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供了一個更為安全有效的選擇。小鼠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(mouse induced neural stem cells, miNSCs)[7]本實驗室已成功獲得，而hiNSCs，都是利用誘導(dǎo)iPSCs的方法通過改變培養(yǎng)環(huán)境或者條件獲得[8-9]，其是否經(jīng)歷了多功能干細(xì)胞的階段尚未清楚，其致瘤性的危險成為臨床治療的阻礙。本實驗應(yīng)用轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子的方式，通過外源因子激活相應(yīng)的內(nèi)源因子表達(dá)，從而使細(xì)胞重新編程，得到類似于NSCs的細(xì)胞，是非常具有臨床研究前景的。

本實驗對iNSCs進(jìn)行了NSCs特異性標(biāo)志物的檢測和增殖分化的檢測，同時也對其與流產(chǎn)胎兒取材來源的hNSCs進(jìn)行了對比，本實驗得到的iNSCs聚集體是一個細(xì)胞雜合體，不單純都是具有增殖能力的iNSCs，其少量分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，未能分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。另外其的增殖能力較差，不能進(jìn)行多代次的傳代培養(yǎng)，相比于取材來源的hNSCs還有一定的差別。

總之，將成體細(xì)胞直接誘導(dǎo)為iNSCs是神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療的研究熱點，本實驗有待于繼續(xù)提升的是誘導(dǎo)iNSCs的效率，和對iNSCs純度的篩選來保證iNSCs的增殖能力。

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Generation of induced neural stem/progenitor cells from human fibroblasts

JIA Wei-li1,2, LI Mo1,2, WU Jian-yu1,2, WANG Shu-yan1,2, CHEN Zhi-guo1,2, ZHANG Yu1,2*

(1.Dept. of Cell Biology；2.Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education,Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China)

ObjectiveTo induce neural stem/progenitor cells (iNSCs) from human fibroblasts.MethodsHuman fibroblasts were infected with lenti-virus expressing green fluorescent protein (GFP) under Pax6 promoter, followed by a puromycin-resistant gene. Puromycin-selected fibroblasts were used as starter cells and infected with virus encoding 10 transcription factorsSox2,Klf4,c-Myc,Tcf3,Ascl1,Brn2,Neurog2,Foxg1,Hes1,Id1, which play critical roles in the development, differentiation, functional stability and plasticity of neural cells. The reprogrammed cells were GFP-positive and were sorted by using flow cytometer and characterized by fluorescence staining and differentiation assay.ResultsiNSC expressed NSC markers (Nestin) and may differentiate into neurons(β Ⅲ-tubulin) and astrocytes(GFAP).ConclusionsHuman fibroblasts can be converted to NSC-likes cells by 10 transcription factors.

induced neural stem/progenitor cells; human fibroblast; reprogramming; transcription factors; pax6 reporter gene

2013-12-26

2014-01-08

國家自然科學(xué)基金(31340075, 31070946)； 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)(2012CBA01307)

*通信作者(correspondingauthor)： yaz@bjsap.org

1001-6325(2014)05-0579-04

Q 28

A