miR-30a表達(dá)載體構(gòu)建、病毒包裝和表達(dá)活性的檢測(cè)

劉 玥，帥 春，尹 虹，宋艷斌*，馬文麗*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 基因工程研究所， 廣東 廣州 510515; 2.廣東省婦幼保健院 新生兒科 越秀院區(qū)， 廣東 廣州 510000)

miR-30a表達(dá)載體構(gòu)建、病毒包裝和表達(dá)活性的檢測(cè)

劉 玥1，帥 春2，尹 虹1，宋艷斌1*，馬文麗1*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 基因工程研究所， 廣東 廣州 510515; 2.廣東省婦幼保健院 新生兒科 越秀院區(qū)， 廣東 廣州 510000)

目的構(gòu)建攜帶miR-30a的慢病毒表達(dá)載體，為研究miR-30a在慢性粒細(xì)胞白血病中的作用機(jī)制及對(duì)伊馬替尼耐藥性的影響奠定基礎(chǔ)。方法提取人骨髓細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增miR-30a的前體序列，克隆到plVTHM慢病毒表達(dá)載體上，測(cè)序鑒定。重組載體進(jìn)行病毒包裝，感染K562細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度。感染的K562細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光的GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，對(duì)分選的細(xì)胞用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-30a在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。最后用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果重組慢病毒表達(dá)載體測(cè)序完全正確；病毒滴度檢測(cè)為6×106TU/mL；選用160 μL病毒液/1 mL培養(yǎng)基感染K562細(xì)胞；感染的K562細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(Plt;0.05)；過表達(dá)miR-30a后K562細(xì)胞增殖水平顯著下降(Plt;0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了miR-30a慢病毒表達(dá)載體，并可在K562細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且miR-30a有抑制K562細(xì)胞增殖的作用。

miR-30a；慢病毒表達(dá)載體；載體構(gòu)建

miRNA是一類長(zhǎng)21～25 nt的小分子非編碼單鏈RNA的總稱，不編碼任何蛋白質(zhì)，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，在生物的各項(xiàng)生理活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[1]。miR-30a位于人6號(hào)染色體長(zhǎng)臂(6q13)，和腫瘤的發(fā)生[2]、轉(zhuǎn)移[3]、侵襲[4]和治療[5]等有密切關(guān)系。miR-30a的表達(dá)改變與肺癌[6]、肝癌[7]、腎小球內(nèi)足細(xì)胞起源的腎臟疾病[8]、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]等的發(fā)生關(guān)系密切，與結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌[10]和肺癌[11]等腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，miR-30a還可調(diào)節(jié)伊馬替尼對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)的治療效果[12]，目前還未明確miR-30a是否通過調(diào)控多個(gè)靶基因，進(jìn)而從多方面調(diào)節(jié)伊馬替尼的治療效果，本研究通過構(gòu)建miR-30a過表達(dá)載體，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為研究伊馬替尼耐藥性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)骨髓、細(xì)胞、菌株：人骨髓樣本(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院提供)，與受試者簽署知情同意書并獲得南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)書；293T細(xì)胞(南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供)；K562細(xì)胞(廣東省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；質(zhì)粒plVTHM、psPAX2、pMD2.G(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院張寶副教授惠贈(zèng))；大腸埃希菌DH5α(Escherichiacoli,E.coli)由本室保存。

(2)酶和主要試劑：限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)；EX Taq DNA聚合酶和SYBRPremixExTaqⅡ(大連寶生物工程公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(GE公司)；QIAamp?DNA Mini and Blood Mini Kit和QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)；Wizard?SV瓊脂糖凝膠和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)(Promega公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit (上海吉瑪公司)；引物合成及測(cè)序由Invitrogen(廣州)公司完成; Cell Counting Kit(CCK-8)(DOJINDO公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取:采用Ficoll法分離正常人骨髓細(xì)胞，采用QIAamp? DNA Mini and Blood Mini Kit提取基因組DNA。

1.2.3 慢病毒顆粒的包裝:在10 cm培養(yǎng)皿中接種293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞達(dá)到50%匯合，采用Lipofectamine 2000，共轉(zhuǎn)染20 μg plVTHM-miR-30a、15 μg psPAX2、6 μg pMD2.G到293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，4 ℃，1 000×g離心10 min，取病毒上清，將上清用0.45 μm濾器進(jìn)行過濾，分裝至1.5 mL EP管，-80 ℃保存。

1.2.4 病毒滴度測(cè)定:把K562細(xì)胞接種到96 孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行感染。設(shè)5個(gè)病毒濃度梯度組，每組加入不同量病毒液，分別為40、80、160、320和640 μL，設(shè)2個(gè)對(duì)照組，1組加polybrene，終濃度5 mg/L，1組為陰性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察并紀(jì)錄每個(gè)稀釋梯度中具有綠色熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)。根據(jù)病毒上清液體積、稀釋的倍數(shù)、GFP熒光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出病毒上清液的滴度：滴度={(%GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〕×(第2天細(xì)胞數(shù)/mL)}/病毒量(mL)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.5 感染:在6孔板中接種K562細(xì)胞，每孔加入320 μL病毒液，加入培養(yǎng)基至2 mL。24 h后，移去病毒上清稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。

1.2.6 分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞:收集感染后的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)miR-30a的表達(dá):采用Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit檢測(cè)miR-30a的表達(dá)，P3為Q-miR-30a上、下游引物混合物：5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGACTATGGTTG TTCTGCTCTCTGTGTC-3′，P4為Q-U6(內(nèi)參)上、下游引物混合物:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，PCR反應(yīng)條件為95 ℃，3 min；95 ℃，12 s，62 ℃，40 s，共40循環(huán)。

1.2.8 細(xì)胞增殖檢測(cè):采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平，分別接種K562細(xì)胞、plv空病毒細(xì)胞、過表達(dá)miR-30a細(xì)胞到96孔板中，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)4 h后，在450 nm測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1慢病毒表達(dá)載體plVTHM-miR-30a的構(gòu)建及鑒定

M.DL2000 Marker(Takara); 1.pre-miR-30a圖1 Pre-miR-30a的擴(kuò)增序列Fig 1 Pre-miR-30a amplification products

PCR產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)為271 bp(圖1)，與預(yù)期一致。酶切鑒定正確(圖2)，送測(cè)序。選擇測(cè)序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，操作結(jié)果如下：

M.DL2000 Marker(Takara); 1.plVTHM-miR-30a圖2 plVTHM-miR-30a酶切結(jié)果Fig 2 plVTHM-miR-30a digestion results

2.2 包裝病毒，滴度測(cè)定，分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞

由plVTHM-miR-30a包裝的病毒命名為30a病毒，由plVTHM包裝的病毒命名為plv病毒。病毒滴度檢測(cè)為6×106TU/mL。不同濃度病毒液感染K562細(xì)胞的感染效率不同(圖3)，最后選擇用160 μL病毒液/1 mL培養(yǎng)基感染細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分選后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，30a病毒感染的細(xì)胞命名為過表達(dá)miR-30a細(xì)胞，plv病毒感染的細(xì)胞命名為plv空病毒細(xì)胞。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)miR-30a表達(dá)水平

plv空病毒細(xì)胞和K562細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)很低且基本一致，miR-30a細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)明顯高于其他兩組(Plt;0.05)(圖4)。

2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

K562細(xì)胞增殖gt;plv空病毒細(xì)胞gt;過表達(dá)miR-30a細(xì)胞(表1、圖5), 過表達(dá)miR-30a細(xì)胞的增殖顯著慢于K562細(xì)胞和plv細(xì)胞(Plt;0.05)。

3 討論

miRNA功能研究的基礎(chǔ)是構(gòu)建成能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)miRNA的載體，根據(jù)導(dǎo)入miRNA結(jié)構(gòu)的不同分為以下4種形式：pri-miRNA(primary-microRNA)、pre-miRNA(precursor-miRNA)、mat-miRNA(mature-miRNA)和amiRNA(artificial-miRNA)。Pri-miRNA是miRNA存在的最原始形式，長(zhǎng)度大約為300～1 000個(gè)堿基，通常取大約400 bp左右的序列，構(gòu)建到含有CMV等啟動(dòng)子的載體上，一般認(rèn)為只有成熟的miRNA才能在體內(nèi)發(fā)揮作用，故很少采用該形式構(gòu)建miRNA真核表達(dá)載體。以pre-miRNA形式構(gòu)建miRNA的表達(dá)載體是應(yīng)用最廣泛的構(gòu)建形式，pre-miRNA大約70 bp，通常上下游各擴(kuò)展100 bp，然后構(gòu)建到含有H1或U6啟動(dòng)子的載體上進(jìn)行表達(dá)，載體選擇性相對(duì)較窄。Mat-miRNA是一類長(zhǎng)度約為22 bp的小分子非編碼單鏈RNA，mat-miRNA誘導(dǎo)基因表達(dá)的效率不如其前體高，因此很少采用。AmiRNA技術(shù)可以迅速分析單個(gè)基因或多個(gè)同源基因以及多個(gè)非同源基因的功能，以天然miRNA前體作為amiRNA前體的骨架，可以產(chǎn)生預(yù)期amiRNA抑制特定靶基因的效果，逐漸受到研究者的關(guān)注。本研究采用pre-miRNA形式構(gòu)建載體，成功構(gòu)建了miR-30a慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)miR-30a的細(xì)胞。

圖3 不同濃度病毒感染K562結(jié)果Fig 3 Different concentrations of virus infection of K562(×10)

*Plt;0.05 compared with cells overexpressed miR-30a圖4 不同細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平Fig 4 miR-30a expression levels in different cells

表1 CCK-8法檢測(cè)不同細(xì)胞增殖的結(jié)果Table 1 The detection of different cells proliferation

*Plt;0.05 compared with K562；#Plt;0.05 compared with plv.

*Plt;0.05 compared with K562 cells;#Plt;0.05 compared with plv cells圖5 CCK-8法檢測(cè)不同細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig 5 The detection of different cells proliferation by CCK-8

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了不同細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明過表達(dá)miR-30a細(xì)胞和K562細(xì)胞相比，增殖水平顯著下降，提示miR-30a可以抑制K562細(xì)胞的增殖。miR-30a在其他腫瘤細(xì)胞中也有類似抑制腫瘤細(xì)胞增殖的情況出現(xiàn)，如肝癌[13]、乳腺癌[14]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]等。在慢粒細(xì)胞中miR-30a抑制細(xì)胞的增殖，是否和伊馬替尼治療慢粒的耐藥機(jī)制有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

總之，本試驗(yàn)為研究miR-30a在慢粒中的表達(dá)調(diào)控及伊馬替尼的耐藥機(jī)制提供了依據(jù)。

[1] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004,116:281-297.

[2] Hatziapostolou M, Polytarchou C, Aggelidou E,etal. An HNF4alpha-miRNA inflammatory feedback circuit regulates hepatocellular oncogenesis[J]. Cell, 2011,147:1233-1247.

[3] Pencheva N, Tran H, Buss C,etal. Convergent multi-miRNA targeting of ApoE drives LRP1/LRP8-dependent melanoma metastasis and angiogenesis[J]. Cell, 2012,151:1068-1082.

[4] Valastyan S, Reinhardt F, Benaich N,etal. A pleiotropically acting microRNA, miR-31, inhibits breast cancer metastasis[J]. Cell, 2009,137:1032-1046.

[5] Premsrirut PK, Dow LE, Kim SY,etal. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference[J]. Cell, 2011,145:145-158.

[6] Yang Y, Li X, Yang Q,etal. The role of microRNA in human lung squamous cell carcinoma[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2010,200:127-133.

[7] Meng XZ, Zheng TS, Chen X,etal. microRNA expression alteration after arsenic trioxide treatment in HepG-2 cells[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011,26:186-193.

[8] Harvey SJ, Jarad G, Cunningham J,etal. Podocyte-specific deletion of dicer alters cytoskeletal dynamics and causes glomerular disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2008,19:2150-2158.

[9] Zhu H, Wu H, Liu X,etal. Regulation of autophagy by a beclin 1-targeted microRNA, miR-30a, in cancer cells[J]. Autophagy, 2009,5:816-823.

[10] Baffa R, Fassan M, Volinia S,etal. MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets[J]. J Pathol, 2009,219:214-221.

[11] Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S. Overexpression of microRNA miR-30a or miR-191 in A549 lung cancer or BEAS-2B normal lung cell lines does not alter phenotype[J]. PLoS One, 2010,5:e9219.

[12] Yu Y, Yang L, Zhao M,etal. Targeting microRNA-30a-mediated autophagy enhances imatinib activity against human chronic myeloid leukemia cells[J]. Leukemia, 2012,26:1752-1760.

[13] Wang W, Lin H, Zhou L,etal. MicroRNA-30a-3p inhibits tumor proliferation, invasiveness and metastasis and is downregulated in hepatocellular carcinoma[J]. Eur J Surg Oncol, 2013, S0748-7983(13)00912-8.

[14] Zhang N, Wang X, Huo Q,etal. MicroRNA-30a suppresses breast tumor growth and metastasis by targeting metadherin[J]. Oncogene, 2013,10.1038/onc.2013.286.

[15] Jia Z, Wang K, Wang G,etal. miR-30a-5p antisense oligonucleotide suppresses glioma cell growth by targeting SEPT7[J]. PLoS One, 2013, 8:e55008.

Construction, packaging and expression activity of miR-30a expression vector

LIU Yue1, SHUAI Chun2, YIN Hong1, SONG Yan-bin1*, MA Wen-li1*

(1.Institute of Genetic Engineering, Southern Medical University, Guangzhou 510515;2.Dept. of Neonatology, Yuexiu Branch of Guangdong Maternal and Child Health Hospital, Guangzhou 510000，China)

ObjectiveTo construct a lentiviral miR-30a expression vector for the study of the mechanism of miR-30a in chronic myeloid leukemia and the impact to imatinib resistance.MethodsHuman bone marrow genomic DNA was extracted, miR-30a precursor sequence was amplificated and cloned into the lentivirus expression vector plVTHM, then sended sequencing. The recombinant vector was packaged in 293T cells and tittered in K562 cells. GFP-positive K562 cells with green fluorescence were sorted by flow cytometry, miR-30a expression level in sorted cells was further detected by RT-PCR. The proliferation of different cells was detected by CCK-8 assay.ResultsSequencing of the recombinant lentiviral expression vector was completely correct; viral titer was 6×106TU/mL; 160 μL virus solution / 1mL medium was selected to infect K562 cells; the expression level of miR-30a in infected K562 cells was significantly enhanced(Plt;0.05); the proliferation levels of cells overexpressed miR-30a decreased significantly (Plt;0.05).ConclusionsmiR-30a lentivirus vector is succ-essfully constructed and miR-30a is stably expressed in K562 cells, and miR-30a may inhibit the proliferation level of K562 cells.

miR-30a; lentiviral vector; vector construction

2013-11-28

2014-01-15

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2013220)，南方醫(yī)科大學(xué)2012年度“科研啟動(dòng)計(jì)劃”青年科技人員培育項(xiàng)目;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B031800135);廣東省自然科學(xué)基金(S2011020003140)

*通信作者(correspondingauthor)： vliuyuemoon@163.com, sunshine@fimmu.com

1001-6325(2014)04-0494-05

研究論文

Q784

A