大環(huán)抗生素手性固定相拆分鹽酸馬布特羅對(duì)映體

張丹丹，王欣欣

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

鹽酸馬布特羅是一種β2腎上腺受體激動(dòng)劑，主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣［1］，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1.鹽酸馬布特羅分子中含有一個(gè)手性中心，具有一對(duì)呈鏡像對(duì)映關(guān)系的異構(gòu)體，但目前應(yīng)用的鹽酸馬布特羅均為外消旋體.手性化合物的對(duì)映體常具有不同的藥理、毒理作用及藥物動(dòng)力學(xué)特征［2-5］，研究表明，在臨床上有效的一般為其左旋體，而其右旋體則對(duì)療效沒(méi)有貢獻(xiàn)［6］.因此，對(duì)鹽酸馬布特羅對(duì)映體進(jìn)行拆分研究，建立簡(jiǎn)單、快速、靈敏、分離性能好的測(cè)定方法是一個(gè)具有理論及實(shí)際意義的課題.目前，對(duì)該藥物的拆分報(bào)道較少，主要有高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法.如郭偉等人用自制3，4-二氯-萬(wàn)古霉素手性固定相分離了馬布特羅對(duì)映體［7］，但分離度只有1.01；韓亞瓊等人在自制替考拉寧手性柱上拆分了馬布特羅對(duì)映體［8］，但分離度只有1.51，均未實(shí)現(xiàn)基線分離；另有楊晶等人用毛細(xì)管電泳法以多種環(huán)糊精為手性添加劑拆分馬布特羅對(duì)映體的報(bào)道［9］.本文作者采用三種大環(huán)抗生素類(lèi)手性固定相Chirobiotic V，T和R（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2）對(duì)鹽酸馬布特羅對(duì)映體直接進(jìn)行了分離，考察了分離模式、流動(dòng)相組成及柱溫的影響，并研究了對(duì)映體的熱力學(xué)行為，探討了手性分離的機(jī)制.

圖1 馬布特羅的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of mabuterol

圖2 三種大環(huán)抗生素類(lèi)手性固定相的結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structures of macrocyclic antibiotic chiral stationary phases

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Jasco UV-980型高壓輸液泵，Jasco UV-975型檢測(cè)器（Jasco日本分光公司），IC 2001plus型柱溫箱，Anastar色譜工作站，U6K型進(jìn)樣閥（20μL定量環(huán)），DT-100A型分析天平，PHS-25型pH計(jì)，DL-180型超聲波清洗機(jī).

鹽酸馬布特羅由青島雙鯨藥業(yè)提供；甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純（天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸、三乙胺、硝酸銨均為特級(jí)純（天津市博迪化工有限公司）.

1.2 色譜條件

色譜柱：Chirobiotic V（250×4.6mmI.D.，5m），Chirobiotic T（150×4.6mmI.D.，5m）和Chirobiotic R（250×4.6mmI.D.，5m）色譜柱（Advanced Separation Technologies Inc.，美國(guó)）.流動(dòng)相：甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）.流速1.0mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；進(jìn)樣量20μL.馬布特羅對(duì)照品用甲醇溶解，配制成濃度為1.0g/L的供試液.

2 結(jié)果與討論

2.1 新極性有機(jī)相模式下鹽酸馬布特羅對(duì)映體的分離

大環(huán)抗生素類(lèi)手性固定相有正相、反相和新極性有機(jī)相三種分離模式.由于此類(lèi)固定相的大環(huán)抗生素類(lèi)結(jié)構(gòu)中具有可離子化基團(tuán)，所以可以將流動(dòng)相組成轉(zhuǎn)變?yōu)?00%甲醇，添加適量的有機(jī)酸和堿來(lái)改善其對(duì)對(duì)映體的選擇性.當(dāng)被分析物的分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)以上可以與手性固定相的手性位點(diǎn)發(fā)生相互作用的官能團(tuán)時(shí)，新極性有機(jī)相模式就可以被使用，而且是首選的分離模式.本文中鹽酸馬布特羅的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)可以與手性固定相的手性位點(diǎn)發(fā)生相互作用的官能團(tuán)，如鹵素，羥基，氨基和苯基等，因此新極性有機(jī)相模式被確定為首選的分離模式.

2.1.1 緩沖溶液類(lèi)型對(duì)分離的影響

在新極性有機(jī)相模式下，化合物的保留行為和對(duì)映體選擇性主要受有機(jī)酸和有機(jī)堿的濃度和比例的影響.考察了0.1%醋酸銨、0.1%硝酸銨和0.1%醋酸三乙胺三種緩沖系統(tǒng)對(duì)分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸馬布特羅在0.1%醋酸銨和硝酸銨緩沖系統(tǒng)中完全不能實(shí)現(xiàn)分離，且色譜峰拖尾，對(duì)稱(chēng)性較差；而在0.1%醋酸三乙胺緩沖系統(tǒng)中可以得到一定的手性分離，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用0.1%醋酸三乙胺做為流動(dòng)相的緩沖系統(tǒng).

2.1.2 緩沖溶液濃度對(duì)分離的影響

以甲醇-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)作為流動(dòng)相，考察了冰醋酸和三乙胺的濃度和比例對(duì)分離的影響.在Chirobiotic R手性固定相上，無(wú)論如何優(yōu)化條件，鹽酸馬布特羅對(duì)映體均不能實(shí)現(xiàn)分離.在Chirobiotic V和T手性固定相上，當(dāng)流動(dòng)相中只含有冰醋酸而不含有三乙胺時(shí)，均只能檢測(cè)到一個(gè)變形的色譜峰，不能實(shí)現(xiàn)手性分離；在含有三乙胺的流動(dòng)相中，鹽酸馬布特羅可實(shí)現(xiàn)一定的分離，冰醋酸的加入對(duì)化合物的手性識(shí)別不起主要作用，但可以改善色譜峰的峰形和對(duì)稱(chēng)性.采用甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.1∶0.1，V/V/V）為起始流動(dòng)相，考察了緩沖液成分（冰醋酸/三乙胺）的濃度對(duì)鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行為和對(duì)映體選擇性的影響.隨著冰醋酸/三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%，鹽酸馬布特羅保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，分離效果顯著提高；但當(dāng)冰醋酸/三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時(shí)，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，色譜峰展寬，分離效果下降.具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1.由此確定甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）為最佳流動(dòng)相，在此條件下，鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上均可實(shí)現(xiàn)基線分離，分離色譜圖見(jiàn)圖3.

表1 流動(dòng)相組成對(duì)鹽酸馬布特羅對(duì)映體保留行為和分離的影響Table 1 Effect of mobile phase compositon on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

圖3 鹽酸馬布特羅對(duì)映體在Chirobiotic V和T手性固定相上的分離色譜圖Fig.3 Enantioseparaion chromatograms of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

2.1.3 柱溫對(duì)分離的影響及熱力學(xué)性質(zhì)研究

本文作者研究了柱溫變化對(duì)鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行為和對(duì)映體選擇性的影響，以甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）為流動(dòng)相，考察了在10，20，30和40℃下的分離情況.隨著溫度的降低，鹽酸馬布特羅的保留時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)映體選擇性有所提高，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.權(quán)衡分離度，保留時(shí)間及實(shí)際操作性，選取最佳分離溫度為20℃.

表2 溫度對(duì)馬布特羅在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響Table 2 The effects of temperature on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T chiral stationary phases

根據(jù)Van’t Hoff等式，色譜參數(shù)、柱溫和熱力學(xué)參數(shù)的關(guān)系為：lnα＝-ΔH/（RT）＋ΔS/R，式中R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，ΔH和ΔS分別代表對(duì)映體與手性固定相相互作用的焓變差和熵變差.在表2考察的溫度范圍內(nèi)，得到鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V手性固定相上的ΔH和ΔS分別為-198.42kJ/mol和-0.38J/mol，在Chirobiotic T手性固定相上的ΔH和ΔS分別為-401.72kJ/mol和-0.95J/mol，數(shù)值均為負(fù)值，表明其手性識(shí)別過(guò)程均為焓控過(guò)程.

2.2 反相模式下鹽酸馬布特羅對(duì)映體的分離

大環(huán)抗生素類(lèi)手性固定相在反相模式下其保留行為和選擇性主要受有機(jī)改性劑的性質(zhì)和濃度，緩沖鹽的性質(zhì)、濃度和pH的影響.本文作者通過(guò)優(yōu)化這些分離條件，在Chirobiotic V手性固定相上可使馬布特羅對(duì)映體部分分離；但在Chirobiotic T和Chirobiotic R手性固定相上均不能實(shí)現(xiàn)分離.

在Chirobiotic V手性固定相上，硝酸銨在多數(shù)情況下已被證明是最佳選擇，為廠家建議使用的緩沖鹽.但在本文中，通過(guò)分離效果的比較，三乙胺醋酸緩沖鹽（0.1%TEAA）被證明分離效果更佳.在該固定相所適應(yīng)的pH范圍內(nèi)（4.0～7.0）考察了緩沖鹽pH的變化對(duì)分離的影響.當(dāng)緩沖鹽的pH在5.5～7.0時(shí)，馬布特羅對(duì)映體可以得到一定的分離；但當(dāng)緩沖鹽的pH低于5.5時(shí)不能實(shí)現(xiàn)分離.在反相模式下，可選用的有機(jī)改性劑包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃等，本文考察了它們的類(lèi)型和濃度對(duì)馬布特羅對(duì)映體保留行為和分離效果的影響.乙醇被證明是適用于此固定相的最佳選擇；當(dāng)采用異丙醇或四氫呋喃作為有機(jī)改性劑時(shí)分離效果較差；采用甲醇或乙腈時(shí)不能實(shí)現(xiàn)手性分離.隨著乙醇在流動(dòng)相中含量由10%增加至70%，馬布特羅的保留時(shí)間隨之延長(zhǎng)，而分離因子和分離度在流動(dòng)相中含有30%乙醇時(shí)達(dá)到此模式下的極大值.其中乙醇含量對(duì)化合物保留行為的影響不符合通常的反相行為，這表明離子化作用在化合物洗脫和對(duì)映體分離時(shí)具有決定性作用.因此，此模式下最佳流動(dòng)相被確定為0.1%TEAA（pH 6.0）-30%乙醇，流速0.6mL/min.在此流動(dòng)相條件下，馬布特羅對(duì)映體可實(shí)現(xiàn)部分分離，分離因子（α）和分離度Rs分別為1.04和0.22.

2.3 正相模式下馬布特羅對(duì)映體的手性分離

在正相模式下，考察了兩種流動(dòng)相系統(tǒng)：正己烷/乙醇和正己烷/異丙醇，并且通過(guò)改變流動(dòng)相組成以求實(shí)現(xiàn)手性分離.令人失望的是，在此模式下，鹽酸馬布特羅對(duì)映體在三種大環(huán)抗生素手性固定相上均不能實(shí)現(xiàn)分離.

2.4 分離機(jī)制的探討

萬(wàn)古霉素，替考拉寧和利托菌素分別是Chirobiotic V，T和R色譜柱的手性選擇劑，它們的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，含有不同的手性中心，包合空腔和各種官能團(tuán).由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它們可與被分離的對(duì)映體發(fā)生π-π相互作用，氫鍵作用，包合作用，偶極作用，立體化學(xué)作用和離子相互作用.鹽酸馬布特羅的結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán)，羥基，鹵素和氨基基團(tuán)，可以與手性選擇劑上相應(yīng)的官能團(tuán)發(fā)生相互作用從而實(shí)現(xiàn)手性分離.新極性有機(jī)相模式可以提升所有這些相互作用，因此在此模式下，鹽酸馬布特羅對(duì)映體可實(shí)現(xiàn)較好的分離.而在新極性有機(jī)相模式下，必須有三乙胺存在于流動(dòng)相中才可實(shí)現(xiàn)對(duì)鹽酸馬布特羅對(duì)映體的分離，當(dāng)流動(dòng)相中同時(shí)含有三乙胺和冰醋酸時(shí)，分離效果最佳，這說(shuō)明離子作用是此模式下對(duì)映體分離的最主要作用機(jī)制，而鹽酸馬布特羅的手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果.

在反相模式下，馬布特羅對(duì)映體的分離受流動(dòng)相中緩沖鹽pH的影響很大，這是因?yàn)轳R布特羅和手性固定相的結(jié)構(gòu)中均含有可離子化基團(tuán)，流動(dòng)相的pH能夠影響它們的離子化狀態(tài)以及手性選擇劑的構(gòu)型，從而影響兩者之間的離子相互作用，進(jìn)而影響分離結(jié)果，這說(shuō)明在反相模式下，離子相互作用也是影響對(duì)映體分離的最主要作用.當(dāng)考察流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量對(duì)保留行為和分離的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)其保留時(shí)間的變化不符合通常的反相行為，隨著流動(dòng)相中乙醇含量的增加，分析物的保留時(shí)間反而延長(zhǎng)，亦表明離子化作用在化合物洗脫和對(duì)映體分離時(shí)具有決定性作用.

在正相模式下，鹽酸馬布特羅對(duì)映體不能得到分離，這進(jìn)一步證明了離子相互作用在鹽酸馬布特羅對(duì)映體分離時(shí)的必要性.因?yàn)殡x子相互作用在正相模式下是很難，甚至不可能發(fā)生的，而鹽酸馬布特羅對(duì)映體分離最主要的機(jī)制就是通過(guò)離子相互作用，所以才致使其對(duì)映體在正相模式下不能實(shí)現(xiàn)分離.

鹽酸馬布特羅對(duì)映體在Chirobiotic V和T固定相上均可得到較好的基線分離，而在Chirobiotic R固定相上卻沒(méi)能實(shí)現(xiàn)手性分離，這主要是由于三種固定相的手性選擇劑的結(jié)構(gòu)存在差異.盡管替考拉寧和利托菌素的結(jié)構(gòu)有些相似，但是兩者之間最顯著的差異就是在利托菌素的結(jié)構(gòu)中含有相對(duì)多的半糖結(jié)構(gòu)，但缺少羧基.鹽酸馬布特羅對(duì)映體在Chirobiotic R固定相上不能實(shí)現(xiàn)分離的現(xiàn)象表明固定相結(jié)構(gòu)中的羧基是與被分析物發(fā)生離子相互作用的重要手性位點(diǎn)之一，而且進(jìn)一步證明了離子相互作用是實(shí)現(xiàn)對(duì)映體分離的最必要作用.手性固定相中的半糖等結(jié)構(gòu)可以為對(duì)映體提供手性空腔，使對(duì)映體由于立體結(jié)構(gòu)差異而實(shí)現(xiàn)手性分離.因此，鹽酸馬布特羅對(duì)映體在Chirobiotic R固定相上不能實(shí)現(xiàn)分離的現(xiàn)象可以解釋為Chirobiotic R固定相缺少能與分析物發(fā)生離子相互作用的位點(diǎn)，且由半糖結(jié)構(gòu)所形成的手性空腔不適合鹽酸馬布特羅對(duì)映體的分離.

3 結(jié)論

采用三種大環(huán)抗生素類(lèi)手性固定相Chirobiotic V，T和R對(duì)鹽酸馬布特羅進(jìn)行了拆分研究，在Chirobiotic V，T手性固定相上成功實(shí)現(xiàn)了其對(duì)映體的基線分離，最大分離度可分別達(dá)3.08和3.73.本文中建立的鹽酸馬布特羅拆分方法簡(jiǎn)單，操作方便，可以用于其對(duì)映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)的研究.

［1］孫定人，董紹俊，張石革，等.國(guó)家臨床新藥集［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001，9：358-359.

［2］GAUSEPOHL C，BLASCHKE G.Stereoselective determination of clenbuterol in human urine by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr B，1998，713（2）：443-446.

［3］BLASCHKE G，KRAFT H P，F(xiàn)ICKENTSCHER K，et al.Chromatographic separation of racemic thalidomide and teratogenic activity of its enantiomers［J］.Arzneimittel-forschung，1978，29（10）：1640-1642.

［4］曾 蘇，李 艷，王似菊.新藥開(kāi)發(fā)中的手性與臨床藥代動(dòng)力學(xué)因素［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，27（9）：430-438.

［5］NATION R L.Chirality in new drug development［J］.Clin Pharmacokinet，1994，27（4）：249-255.

［6］GAUSEPOHL C，BLASCHKE G.Stereoselective determinationof clenbuterol inhumanurine by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr B，1998，713（2）：443-446.

［7］郭 偉，余小燕，谷曉娟，等.3，4-二氯-萬(wàn)古霉素手性固定相拆分克倫特羅和馬布特羅對(duì)映體［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（5）：4-6.

［8］韓亞瓊，余小燕，谷曉娟，等.克倫特羅和馬布特羅在替考拉寧手性柱上的對(duì)映體分離［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（6）：12-16.

［9］JING Y，LU X M，LI P，et al.Simultaneous enantioseparation of four b2-agonists by capillary electrophoresis with cyclodextrin additives：Study of the enantioselective mechanism［J］.J Sep Sci，2008，31：3749-3754.