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    TLR4通路對polyI:C誘導肝癌細胞凋亡的影響①

    2014-11-27 11:15:56趙華俊韓秋菊山東大學藥學院免疫藥理與免疫治療學研究所濟南250012
    中國免疫學雜志 2014年1期
    關鍵詞:預處理受體通路

    趙華俊 林 昂 韓秋菊 張 建 (山東大學藥學院免疫藥理與免疫治療學研究所,濟南250012)

    Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一類模式識別受體,在生物體進化過程中高度保守[1]。大量研究表明,TLRs在多種細胞中均有表達,其中以免疫細胞表達為主,如樹突狀細胞、T細胞、中性粒細胞等[1,2]。TLRs的活化在宿主抵抗外來病原體感染和組織損傷的天然免疫應答過程中發(fā)揮著重要作用,并可以通過多種機制間接調節(jié)獲得性免疫應答。

    早期的研究主要是立足于表達在免疫細胞上TLRs的生物學功能及其重要性。然而近年的研究發(fā)現(xiàn),TLRs在一些腫瘤細胞,如黑色素瘤細胞、結腸癌細胞、乳腺癌細胞等均有表達。而TLRs對不同種類腫瘤細胞發(fā)揮著不同的生物學功能。例如,人頭頸部鱗癌細胞系上的TLR4活化后能夠促進腫瘤的發(fā)展,并保護腫瘤免受免疫系統(tǒng)攻擊[3];乳腺癌細胞的TLR5在活化后能夠抑制細胞增殖,從而抑制腫瘤的生長[4,5]。因此,研究 TLR激動劑對腫瘤的直接作用,對于腫瘤的免疫治療具有重要的意義。

    polyI:C是一種病毒雙鏈RNA的模擬物,已有文獻報道,它不僅對免疫細胞(如自然殺傷細胞)具有激活作用,而且還可以直接誘導腫瘤細胞的凋亡[4],已作為一種有效的抗腫瘤免疫佐劑被廣泛研究。由于所處的特殊生理環(huán)境,肝臟部位長期接觸腸道菌群及其產(chǎn)物,難以避免與細菌成分脂多糖(LPS)相接觸。本文旨在探討LPS對polyI:C誘導肝癌細胞凋亡的影響并進行初步的機制探討。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞系 人肝癌細胞系H7402購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫(北京,中國),并在本實驗室保存。

    1.1.2 試劑 RPMI1640購于Gibco公司;胰酶購自上海生工生物工程有限公司;新生牛血清、胎牛血清購自杭州四季青公司;LPS、polyI:C購于Sigma公司;DMSO購于上海生工生物工程技術服務有限公司;Lipofectin2000、Trizol、M-MLV逆轉錄酶試劑盒購自美國Invitrogen公司;SYRB Green Mix購自日本ToYoBo公司;Western blot檢測RIG-I、MDA5抗體購自美國CST公司;TLR4阻斷劑TAK242購自美國Invivogen公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑為國產(chǎn)分析純,引物由北京華大基因有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)及細胞干預 H7402細胞以含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的條件下。將細胞接種于12孔板中,待細胞貼壁后,用 LPS(10 μg/ml)預處理 24 h;進行polyI:C(1 μg/ml)轉染6 h后,更換有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h,然后進行下一步檢測。

    1.2.2 熒光定量PCR 參照Trizol說明書,Trizol法提取方法1.2.1處理細胞的總RNA。將總RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR反應,或采用熒光定量PCR的方法檢測凋亡相關基因 Bad、Bax、Bim、Bad、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 及 polyI:C 的胞內 RNA 識別受體 RIG-I、MDA5、TLR3、LGP2的表達水平。該方法使用 SYBR Green Master Mix,iCycleriQ Realtime PCR儀進行檢測。所用到的引物序列見表1。

    1.2.3 Western blot法檢測細胞RIG-I、MDA5蛋白表達水平[6]各組細胞培養(yǎng)48 h后采用蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白;經(jīng)10%SDS-PAGE分離后,電轉至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的1×TBST液封閉,然后分別以相應的一抗、二抗標記,最后,PVDF膜于Bio-RAD成像儀上以化學發(fā)光法曝光顯影。

    1.2.4 PI/Annexin V雙染法檢測細胞凋亡 收集方法1.2.1處理的細胞于流式管中,1×PBS清洗一遍,200 μl Annexin V結合液重懸細胞,混勻,每管加入2.5 μl FITC-Annexin V染液,4℃避光孵育15 min,每管再加入 PI 5 μl,4℃避光孵育 5 min 后,用流式細胞儀檢測。

    表1 用于定量PCR的引物序列Tab.1 Primer sequences used for Real-time quantitative PCR

    1.3 統(tǒng)計學方法 兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。P<0.05認為有差異,P<0.01為具有顯著性的統(tǒng)計學差異。

    2 結果

    2.1 LPS可抑制polyI:C誘導的H7402細胞凋亡如圖1A顯示,H7402細胞表達TLR3、TLR4;經(jīng)10 μg/ml LPS 刺激24 h,再轉染 polyI:C(1 μg/ml)作用24 h,細胞凋亡程度明顯低于polyI:C單處理組,提示LPS可能有抵抗polyI:C誘導H7402細胞凋亡的作用,見圖1B,圖1C所示內容為圖1B的統(tǒng)計圖。

    圖1 LPS可抑制polyI:C誘導的H7402細胞凋亡Fig.1 LPS inhibits polyI:C-induced the apoptosis of H7402 cells

    圖2 LPS可通過TLR4信號通路抑制polyI:C誘導的H7402細胞凋亡Fig.2 LPS inhibits induced H7402 via TLR4 signaling pathway

    2.2 LPS通過TLR4信號通路抑制polyI:C誘導的H7402細胞凋亡 為研究LPS是否通過激活TLR4通路而減弱polyI:C誘導的H7402細胞凋亡,首先使用TLR4阻斷劑TAK242處理H7402細胞2 h,然后加入10 μg/ml LPS刺激 24 h,再轉染 1 μg/ml polyI:C刺激24 h。檢測結果如圖2顯示,TLR4被阻斷后,LPS將不影響polyI:C誘導的細胞凋亡,表明LPS對polyI:C誘導凋亡的影響可能是通過TLR4信號通路介導的。

    2.3 LPS預處理可影響細胞凋亡相關基因的表達為研究LPS是否影響polyI:C所誘導的凋亡相關基因表達,采用熒光定量PCR法檢測結果顯示,polyI:C單獨刺激可以顯著上調Noxa表達,但經(jīng)LPS預處理后,Noxa表達上調的幅度顯著下降;而促凋亡基因Bad、Bax、Bim、Bid及抑凋亡基因Bcl-x1的表達無明顯差異,雖然抑凋亡基因Bcl-2表達略微有所上升,Mcl-1表達略微有所下降,但是因為細胞凋亡是一個多基因調控的復雜過程,在此細胞凋亡過程中Bcl-2、Mcl-1微小變化可能并不是關鍵性的因素,而發(fā)生顯著性變化的Noxa可能發(fā)揮更直接的作用(圖3)。

    圖3 LPS的預處理對H7402細胞中凋亡相關基因表達的影響Fig.3 LPS pre-treatment influenced the expression of the apoptosis genes

    圖4 LPS可抑制polyI:C誘導RNA模式識別受體的表達Fig.4 LPS pretreatment suppresses the expression of intracellular recognition receptors induced by polyI:C

    2.4 LPS對H7402細胞RNA模式識別受體表達的影響 為進一步研究LPS對polyI:C凋亡影響的可能機制,熒光定量PCR方法檢測,polyI:C胞內相關識別受體發(fā)現(xiàn)H7402細胞經(jīng)LPS預處理后,MDA5、RIG-I基因表達水平顯著下調(圖4A),而 LGP2、TLR3表達水平?jīng)]有明顯變化(數(shù)據(jù)未顯示);同時Western blot方法檢測;經(jīng)LPS預處理后,H7402細胞MDA5、RIG-I蛋白表達水平顯著下調(圖4B),提示LPS預處理可能導致了polyI:C的胞內識別受體MDA5、RIG-I表達下降,影響了polyI:C與受體的結合,從而阻礙polyI:C發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用。

    3 結論

    TLRs作為重要的模式識別受體,不僅表達在免疫細胞上,在多種腫瘤細胞及組織中也廣泛表達[7-9]。一方面,免疫細胞中TLRs的活化,參與了機體抵抗外來病原體感染的天然免疫應答過程,而TLRs激動劑由于其特有的免疫刺激活性,也被廣泛地用于免疫佐劑的研究中[10]。另一方面,腫瘤細胞表面TLRs所介導的下游炎癥因子的產(chǎn)生,參與了腫瘤微環(huán)境的形成,進而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了不同的作用[11-13]。而不同TLRs家族成員信號通路之間的交互作用使得TLRs的生物學功能更為復雜。對于腫瘤細胞的不同TLRs配體之間的相互作用的研究有待進一步深入研究。

    為了觀察LPS對polyI:C誘導H7402細胞凋亡的影響,我們采用LPS刺激細胞24 h,再轉染polyI:C作用24 h,細胞凋亡程度明顯低于polyI:C單處理組,說明LPS可能具有抵抗polyI:C誘導H7402細胞凋亡的作用。為了研究LPS是否通過激活TLR4通路減弱polyI:C誘導H7402細胞凋亡,我們使用TLR4阻斷劑TAK242處理H7402細胞2 h,再加入LPS刺激24 h,轉染polyI:C刺激24 h。結果顯示,TLR4被阻斷后,LPS將不影響polyI:C誘導的細胞凋亡,表明LPS對polyI:C誘導凋亡的影響可能是通過TLR4信號通路介導的。

    細胞凋亡過程受一系列相關基因的調控,包括促凋亡基因(Noxa、Bim)和抗凋亡基因(Bcl-xl、Bcl-2)等。為了研究LPS是否影響polyI:C所誘導凋亡相關基因的表達,我們采用熒光定量PCR方法檢測結果顯示,polyI:C單獨刺激可以顯著上調H7402細胞Noxa的表達,但經(jīng)LPS預處理后,Noxa上調幅度顯著下降;而促凋亡基因Bad、Bax、Bim、Bid及抑凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2的表達無明顯變化。雖然,polyI:C刺激H7402細胞后,抑凋亡基因Mcl-1的表達也上調,但其上調幅度顯著低于Noxa且不受LPS的影響。這些現(xiàn)象提示,與Noxa相比,Mcl-1可能不是polyI:C誘導H7402細胞凋亡的關鍵性因素。PolyI:C主要被細胞內RNA模式識別受體所識別,包括 TLR3、RIG-1、MDA5和 LGP2,進而介導下游信號通路的活化,發(fā)揮相應的生物學功能。我們觀察到,將H7402細胞經(jīng)LPS處理后,polyI:C識別受體MDA5、RIG-I基因及蛋白表達水平顯著下調,而LGP2、TLR3表達水平?jīng)]有明顯變化。表明LPS預處理影響了polyI:C與受體的結合,從而阻礙polyI:C發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用。

    polyI:C能誘導腫瘤細胞凋亡[14-17],這對抗腫瘤藥物的研發(fā)及臨床應用提供了新的策略。對于肝癌細胞,polyI:C具有同樣促凋亡作用。但由于肝臟所處的特殊生理環(huán)境,其長期不斷地受到腸道菌群的侵襲,難以避免與細菌內毒素LPS接觸[1]。本文研究結果提示,在臨床應用polyI:C進行肝癌的免疫治療時,聯(lián)合小分子藥物阻斷TLR4,可能是一種有效的新型治療策略。

    [1]Zhang Y,Qu J,Zhang J.The effects of TLR4 activation on the characterizations of digestive system associated cancers[J].Chin J Immun,2012,28(8):695-700.

    [2]Chrystal MP,Andrew K,Claudia W,et al.Toll-like Receptors in Tumor Immunotherapy[J].Clin Cancer Res,2007,13(18):5280-5289.

    [3]Michael G,Kelly,Ayesha B,et al.TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer[J].Cancer Res,2006,66(7):3859-3868.

    [4]Bruno S,Isabelle C,Rissoan MC,et al.TLR3 can directly trigger apotosis in human cancer cells[J].J Immunol,2006,176(8):4894-4901.

    [5]Claire JG,Stefan RJ,Rami L,et al.IL-6 trans-signaling modulates TLR4-depengdentinflammatory responses via STAT3[J].J Immunol,2011,186(2):1199-1208.

    [6]Wang J,Yu S,Chen C,et al.Immunomodulatory effects fo polysaccharopeptide on TLR signaling pathway of PBMC through MyD88 in patients with breast cancer[J].Chin J Immun,2013,29(3):236-239.

    [7]Kumagai Y,Takeuchi O,Akira S.Pathogen recognition by innate receptors[J].J Infect Chemother,2008,14(2):86-92.

    [8]Szczepanski MJ,Czystowska M,Szajnik M,et al.Triggering of toll-like receptor 4 expressed on human head and neck squamous cell carcinoma promotes tumor development and protects the tumor from immune attack [J].Cancer Resarch,2009,69(7):3105-3113.

    [9]Sato Y,Goto Y,Narita N,et al.Cancer cells expressing toll-like receptors and the tumor microenvironment[J].Cancer Microenviron,2009,2(1):205-214.

    [10]Seth RN,Ruslan M.Toll-like receptors and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2009,9(1):57-63.

    [11]Curtin JF,Liu N,Candolfi M,et al.HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression [J].PLoS Med,2009,6(1):10.

    [12]Fukata M,Chen A,Vamadevan AS,et al.Toll-like receptor-4 promotes the development of colitis-associated colorectal tumors[J].Gastroenterology,2007,133(6):1869-1881.

    [13]Goto Y,Arigami T,Kitago M,et al.Activation of Toll-like receptors 2,3,and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors[J].Mol Cancer Ther,2008,7(11):3642-3653.

    [14]Sun X,Zhang J,Wang L,et al.Growth inhibition of human hepatocellar carcinoma cells by blocking STAT3 activation with decoy-ODN [J].Cancer Lett,2008,262(2):201-213.

    [15]Apetoh L,Ghiringhelli F,Tesniere A,et al.Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy[J].Nat Med,2007,13(9):1050-1059.

    [16]Huang B,Zhao J,Li H,et al.Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J].Cancer Res,2005,65(12):5009-5014.

    [17]Chen R,Alvero AB,Silasi DA,et al.Inflammation,cancer and chemoresistance:taking advantage of the toll-like receptor signaling pathway[J].Am J Reprod Immunol,2007,57(2):93-107.

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