穴位注射胞二磷膽堿對(duì)腦外傷大鼠生長相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響

郭知學(xué)，李鷗，汪春，馮曉梅

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)是常見的嚴(yán)重致殘性神經(jīng)系統(tǒng)傷病。腦外傷后遺癥的功能障礙包括運(yùn)動(dòng)障礙、疼痛、感知和認(rèn)知障礙、精神/心理障礙等[1]。

穴位注射是在傳統(tǒng)的針灸療法基礎(chǔ)上，選擇合適的穴位注入適量的液體藥物，以防治各類疾病的方法。本實(shí)驗(yàn)觀察足三里穴位注射胞二磷膽堿對(duì)腦外傷大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)的影響，以探討穴位注射神經(jīng)營養(yǎng)劑對(duì)腦外傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)蛋白的合成和促進(jìn)神經(jīng)再生與神經(jīng)功能康復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(軍)2007-016。注射用胞二磷膽堿鈉：閩東力捷迅公司。兔抗鼠GAP-43單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司。兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型制備及分組

采用改良Feeney法[2]復(fù)制自由落體腦損傷模型。大鼠術(shù)前禁食8 h，禁水2 h。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥固定于腦立體定位儀上。右側(cè)顱頂部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。右側(cè)顱頂旁正中切口，長約3 cm，分離皮膚，切開骨膜，向兩側(cè)分離，露出約1×1 cm顱骨，皮下少量出血以電凝止血。以前囟后1.5 mm為中心鉆孔，蚊式鉗擴(kuò)大骨窗至4 mm(注意保護(hù)矢狀竇和保持硬腦膜完整)。將其置于自由落體底部，40 g砝碼從25 cm高處滑下，撞擊于骨窗之硬膜上，致傷面積1 cm2，下陷深度約2 mm。假手術(shù)組(A組)大鼠8只，麻醉后同樣皮膚切口、暴露骨窗及縫合，但不進(jìn)行重力撞擊。造模成功大鼠32只用抽簽法分為穴位注藥組(B組)、穴位注水組(C組)、腹腔給藥組(D組)和腹腔注水組(E組)各8只。

1.3 干預(yù)方法

胞二磷膽堿粉針以生理鹽水溶解為500 mg/ml。足三里穴定位采用擬人比照法，取大鼠后膝關(guān)節(jié)外下方腓骨小頭下約5 mm處，直刺5 mm。

B組以500 mg/kg足三里穴位注射，注射體積0.25～0.3 ml；C組足三里穴注射等體積生理鹽水；D組胞二磷膽堿500 mg/kg腹腔注射；E組造模后腹腔注射等體積生理鹽水。A組腹腔注射等體積生理鹽水。

各組注藥、注水均于致傷后30 min開始首次注射，每天1次，連續(xù)給藥14 d。各組動(dòng)物于術(shù)后28 d處死。

1.4 觀測指標(biāo)及方法

1.4.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠分別于術(shù)前及術(shù)后1 d、8 d、14 d參照Bederson的方法[3]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：提鼠尾離開地面約30 cm，觀察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，分別從兩側(cè)推動(dòng)其雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力有無差異；大鼠置于地面，觀察行走情況。采用5級(jí)評(píng)分法(0～4分)：0分，行為完全正常，步態(tài)平穩(wěn)；1分，提起鼠尾離開地面，非損傷側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收；2分，將大鼠置于地面，推動(dòng)大鼠軀體檢查兩側(cè)抗力，非損傷側(cè)抗力下降；3分，將大鼠置于地面，觀察其行走，只向一側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分，無法站立或雖能站立但不能自行行走。

1.4.2 曠場實(shí)驗(yàn)(open-field test) 各組大鼠置于40×80×80 cm的方形曠場中，內(nèi)壁為黑色，曠場底面分成面積相等的25塊正方形格。正上方2 m處架一攝像機(jī)，鏡頭對(duì)準(zhǔn)箱底。室內(nèi)隔音，大鼠置于方箱底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。記錄動(dòng)物行為，每次測定時(shí)間3 min。以穿越底面的格數(shù)作為水平積分，以兩前肢同時(shí)離地的次數(shù)作為垂直積分，兩者之和為曠場試驗(yàn)積分[4]。于術(shù)前及術(shù)后15 d、22 d各測1次。

1.4.3 腦組織免疫組化染色 術(shù)后28 d各組大鼠4%多聚甲醛300～500 ml心臟灌注，90 min后斷頭，取出全腦，4%多聚甲醛固定4 h。常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。損傷區(qū)取材切片，片厚10μm，每隔100 μm取1張，每個(gè)標(biāo)本共取6張，取3張行免疫組化染色。

3%H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原微波修復(fù)；加入兔抗大鼠GAP-43抗體，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加聚合物輔助劑，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次；滴加辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多聚體，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中的試劑2；滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5～10 min，蒸餾水洗滌終止染色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，同步免疫組化染色處理，結(jié)果為陰性。

1.4.4 圖像分析處理 應(yīng)用IBAS 2000圖像分析系統(tǒng)測定大鼠大腦皮層損傷周圍區(qū)的光密度值(OD)。每只大鼠腦切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(400×)，取平均值；同時(shí)測定同一張切片上胼胝體OD值作為背景，損傷周圍區(qū)OD值減去背景OD值得到校正光密度值(COD)，用于比較分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

術(shù)前各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分。術(shù)后，A組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分，低于其余各組(P<0.05)。術(shù)后1 d造模各組大鼠多為3分：提尾表現(xiàn)為損傷對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋或內(nèi)收，側(cè)向擠壓時(shí)損傷對(duì)側(cè)抗力減低，多數(shù)可以轉(zhuǎn)圈行走，少數(shù)大鼠無法站立或行走。術(shù)后8 d、14 d，造模各組大鼠評(píng)分逐漸下降，B組評(píng)分低于另外3組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 曠場試驗(yàn)

術(shù)前，各組大鼠精神狀態(tài)良好，有較高的活動(dòng)興奮性。A組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中處于平穩(wěn)狀態(tài)。術(shù)后15 d及22 d，造模各組A組穿越格子數(shù)和站立次數(shù)減少，曠場試驗(yàn)評(píng)分下降(P<0.05)；B組評(píng)分高于另外3組(P<0.05)。見表2。

2.3 GAP-43

GAP-43陽性細(xì)胞胞漿著棕黃色，主要分布于損傷區(qū)周圍和大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞。B組GAP-43陽性表達(dá)明顯多于C組、D組和E組(P<0.05)。見表3。

3 討論

顱腦外傷治療中最重要和最困難的是對(duì)認(rèn)知、情感和行為功能障礙的處理[1]。胞二磷膽堿能夠促進(jìn)腦組織代謝，改善腦微循環(huán)，興奮膽堿能神經(jīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的認(rèn)知功能恢復(fù)等方面有效[5-6]。穴位注射若選擇的經(jīng)絡(luò)、腧穴適當(dāng)，藥物作用出現(xiàn)時(shí)間與效果優(yōu)于肌肉注射，與靜脈注射效果相當(dāng)甚至更佳[7]。我們以往的研究顯示，穴位注射胞二磷膽堿對(duì)腦外傷大鼠的認(rèn)知、記憶能力和神經(jīng)功能均有明顯的改善作用[8-9]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突自發(fā)再生能力十分有限，因此中樞神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)之一。近年來，GAP-43已成為學(xué)者研究的焦點(diǎn)，關(guān)于GAP-43參與中樞神經(jīng)損傷修復(fù)的研究大量展開。

GAP-43是一種神經(jīng)元特異性蛋白，主要表達(dá)于發(fā)育或再生軸突的生長錐末端，參與軸突生長、突觸重構(gòu)以及兒茶酚胺和神經(jīng)肽類物質(zhì)的分泌[10-11]。在腦功能活躍區(qū)表達(dá)量很高。大量研究證實(shí)，GAP-43的表達(dá)與成年動(dòng)物神經(jīng)元軸突再生及可塑性密切相關(guān)[12]。電針刺激足三里穴能夠增加腦梗死大鼠梗死灶GAP-43表達(dá)，從而改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，促進(jìn)其神經(jīng)功能重塑[13]。

曠場試驗(yàn)反映大鼠在新環(huán)境中探究行為和適應(yīng)能力的方法[14]，結(jié)合神經(jīng)功能缺損評(píng)分，可以反映大鼠行為功能和認(rèn)知功能的情況。

大鼠腦損傷后，神經(jīng)功能明顯障礙，神經(jīng)功能缺損評(píng)分及曠場試驗(yàn)得分均下降；隨著觀察時(shí)間延長，大鼠功能得到一定恢復(fù)，穴位注射胞二磷膽堿組功能恢復(fù)優(yōu)于其他各組。

免疫組化染色顯示，造模大鼠在腦損傷后第28天均出現(xiàn)GAP-43表達(dá)上調(diào)，提示這種蛋白表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后重建過程中具有很大潛能；穴位注射胞二磷膽堿可以上調(diào)GAP-43蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)。

綜上所述，穴位注射神經(jīng)保護(hù)劑療法和GAP-43蛋白表達(dá)有望為神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的康復(fù)治療開辟一條新的途徑。

[1]勵(lì)建安.腦外傷康復(fù)的現(xiàn)狀與未來發(fā)展趨勢[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(12):881-883.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67-77.

[3]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[4]Vecsei L,Ailing C,Heiling M,et al.Effects of xysteamine and pantethine on open-field behavior,hypothalamic catecholamine concentrations and somatostatin-induced barrel rotation in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,1989,32(3):629-631.

[5]Zweifler RM.Menbrane stabilizer:citicoline[J].Curr Med Res Opin,2002,28(2):14-17.

[6]Conant R.Therapeutic application of citicoline for stroke and cognitive dysfunction in the elderly:a review of the literature[J].Altern Med Rev,2004,9(1):17-31.

[7]吳煥淦,趙琛,陳漢平.略論穴位注射[J].中國針灸,1995,(5):303-305.

[8]李鷗,郭知學(xué),汪春.穴位注射胞二磷膽堿對(duì)腦外傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(12):1116-1118.

[9]郭知學(xué),李鷗,汪春.穴位注射胞二磷膽堿對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能障礙的影響[J].中國康復(fù),2013,28(2):90-92.

[10]Frey D,Laux T,Xu L,et al.Shared and unique roles of CAP23 and GAP43 in actin regulation,neurite outgrowth,and anatomical plasticity[J].JCell Biol,2000,149(7):1443-1454.

[11]李惠蘭,劉蘭群,盧虎英,等.減重步行訓(xùn)練和督脈電針對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子及生長相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(10):930-933.

[12]Burfo A,Hohmaat AJ,Savio T,et al.Targeted overexpression of the neurite growth-associated protein B-50/GAP-43 in cerebellar Purkinje cells induces sprouting after axotomy but not axon regeneration into growth-permissive transplants[J].Neuroscience,1997,17(22):8778-8791.

[13]周元成,吳新貴,肖貽財(cái),等.電針刺激“足三里”和“內(nèi)關(guān)”對(duì)腦梗死大鼠GAP-43表達(dá)的影響[J].中國針灸,2011,31(1):55-59.

[14]朱星,廖榮鑫,呂東勇.脾胃濕熱證大鼠HPA軸改變機(jī)制的研究[J].新中醫(yī),2010,42(10):115-116.