紫外分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中胞二磷膽堿鈉含量

陳天來，彭奇均

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122)

胞二磷膽堿鈉(CDPC)是卵磷脂生物合成的重要前體，對(duì)于改善腦組織代謝，促進(jìn)大腦功能恢復(fù)和促進(jìn)蘇醒有較好的療效，其在臨床上常用于急性顱腦外傷和腦手術(shù)后的意識(shí)障礙［1］。

目前，主要采用生物發(fā)酵法合成胞二磷膽堿鈉［2］。生物發(fā)酵合成胞二磷膽堿鈉時(shí)，在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅活和固液分離后，發(fā)酵液中除胞二磷膽堿鈉外還常含有蛋白質(zhì)等物質(zhì)，常采用離子交換樹脂吸附分離其中的雜質(zhì)以純化胞二磷膽堿鈉［2-5］。

胞二磷膽堿鈉的主要檢測(cè)方法有:HPLC法［6-7］、紫外分光光度法［8-10］。HPLC 法操作復(fù)雜，分析條件較為苛刻，不利于發(fā)酵、分離過程中胞二磷膽堿鈉的快速檢測(cè);紫外分光光度法具有快速、簡(jiǎn)便、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。

紫外分光光度法需將胞二磷膽堿鈉配制成含0.1 mol/L鹽酸的溶液，在280 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，而采用離子交換樹脂分離純化胞二磷膽堿鈉的過程中伴隨著溶液pH的變化，在不能確定溶液pH的情況下傳統(tǒng)的紫外分光光度法不適用于胞二磷膽堿鈉分離純化過程中的分析。

雖然傳統(tǒng)的紫外分光光度法并不適用于分離純化過程中胞二磷膽堿鈉的分析，但可通過改進(jìn)使其能分析任意pH溶液中的胞二磷膽堿鈉含量。本文基于紫外分光光度法，以有別于傳統(tǒng)紫外分光光度法在280 nm下分析，選擇不受溶液 pH影響的265 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)作為改進(jìn)方向，同時(shí)研究了不同操作溫度、蛋白質(zhì)濃度等因素對(duì)該方法的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品、胞二磷膽堿鈉發(fā)酵液均由蘇州天馬醫(yī)藥集團(tuán)提供;鹽酸、氫氧化鈉均為分析純;牛白蛋白，生物試劑。

TU1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(帶恒溫水浴裝置);pH S-25型pH計(jì);EL204電子分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液 以鹽酸及氫氧化鈉為溶質(zhì)，配制 pH 值分別為 0，2，4，10，12，14的溶液。精密稱取胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品500 mg于燒杯中，加入去離子水溶解并定容于100 mL容量瓶中。

分別準(zhǔn)確移取胞二磷膽堿鈉溶液6，10，16，20，24，30 mL于100 mL容量瓶中，分別加入10 mL不同pH溶液，定容至刻度線。最終使?jié)舛确謩e為30，50，80，100，120，150 μg/mL 的不同濃度的胞二磷膽堿鈉溶液均有 pH 分別為 2，4，6，8，10，12 的胞二磷膽堿鈉溶液。

1.2.2 含不同濃度牛白蛋白的胞二磷膽堿鈉溶液(含胞二磷膽堿鈉2.5 mg/mL) 精密稱取2.500 g的胞二磷膽堿鈉分別以濃度為 50，75，100，125，150μg/mL的牛白蛋白溶液溶解并定容于100 mL容量瓶。

1.2.3 胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)液(0.5 mg/mL) 精密稱取胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，加入去離子水溶解后定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取 1，2，4，6，8，10，12，16，20，30 mL的胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)液至100 mL容量瓶中，并用去離子水定容，測(cè)定其在265 nm波長(zhǎng)下的吸光度。以胞二磷膽堿鈉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，見圖1。

圖1 胞二磷膽堿鈉濃度與吸光度的關(guān)系Fig.1 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖1可知，胞二磷膽堿鈉溶液在0～150μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好，擬合直線方程為 A=0.014 3C+0.001 9，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液p H對(duì)胞二磷膽堿鈉吸光度的影響

以去離子水為參比，不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液在210～360 nm掃描結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度胞二磷膽堿鈉溶液在不同pH下的光譜掃描曲線Fig.2 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖2可知:①胞二磷膽堿鈉濃度30～150 g/mL范圍內(nèi)，隨pH增大，胞二磷膽堿鈉溶液的最大吸收波長(zhǎng)減小;當(dāng)pH＞6時(shí)，胞二磷膽堿鈉吸光度光譜掃描曲線在210～360 nm的范圍內(nèi)基本重合，pH對(duì)胞二磷膽堿鈉吸光度的測(cè)量無影響;②在30～150 g/mL的濃度范圍內(nèi)，相同濃度下，不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液的光譜掃描曲線均相交于同一點(diǎn)，即在265 nm波長(zhǎng)處不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液吸光度均相同，即265 nm下胞二磷膽堿鈉吸光度與pH大小無關(guān)，故選擇265 nm作為胞二磷膽堿鈉的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 蛋白質(zhì)的干擾

將含不同濃度牛白蛋白的胞二磷膽堿鈉溶液稀釋100倍后，以去離子水為參比液，測(cè)定其在265 nm波長(zhǎng)下的吸光度。結(jié)果胞二磷膽堿鈉及蛋白質(zhì)在紫外光區(qū)的吸收區(qū)間幾乎重疊，即在265 nm的波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)可能會(huì)對(duì)胞二磷膽堿鈉分析測(cè)定產(chǎn)生干擾。

經(jīng)分析，胞二磷膽堿鈉發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量約為94μg/mL，故配制蛋白質(zhì)濃度分別為 0～150μg/mL且含25 mg/mL胞二磷膽堿鈉混合溶液，測(cè)定其265 nm波長(zhǎng)下的吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)濃度對(duì)胞二磷膽堿鈉含量分析的影響Fig.3 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖3可知，在265 nm波長(zhǎng)測(cè)定得到吸光度的波動(dòng)＜1.5%，表明蛋白質(zhì)對(duì)該方法分析胞二磷膽堿鈉濃度影響小，可忽略不計(jì)。

2.3 測(cè)定溫度的影響

分別精密量取 2，4，8，12，16，20 mL 的胞二磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)液至100 mL容量瓶中，并用去離子水定容，分別在10，15，20，25，30 ℃的恒溫條件下測(cè)定其在265 nm波長(zhǎng)下的吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 胞二磷膽堿鈉溶液吸光度與溫度的關(guān)系Fig.4 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖4可知，在10～30℃的范圍內(nèi)胞二磷膽堿鈉溶液在265 nm下的吸光度呈現(xiàn)水平，說明吸光度不受溫度的影響，故可在10～30℃的范圍內(nèi)的任意溫度下測(cè)定胞二磷膽堿鈉濃度。

2.4 方法的精密度及加標(biāo)回收率

2.4.1 精密度 重復(fù)測(cè)定同一樣品在265 nm的吸光度，結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Precision experimental result

由表1可知，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.178%，表明方法精密度較高。

2.4.2 加標(biāo)回收率 吸取10 mL濃度為30μg/mL的胞二磷膽堿鈉溶液8份，分別加入10 mL濃度為40，50μg/mL的胞二磷膽堿鈉溶液混合均勻，測(cè)定其吸光度，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率Table2 Recovery of standard addition

由表2可知，各樣品的加標(biāo)回收率均＞95%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

以265 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，建立了胞二磷膽堿鈉的紫外吸收分析法，此波長(zhǎng)下胞二磷膽堿鈉吸光度不受溶液pH影響。由于發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量小，對(duì)胞二磷膽堿鈉分析影響可忽略，并且此方法在10～30℃的范圍內(nèi)不影響胞二磷膽堿鈉分析。

胞二磷膽堿鈉濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度呈線性相關(guān)，其線性回歸方程為A=0.014 3C+0.001 9，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7，線性范圍為 5～100μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.178%，平均加標(biāo)回收率為100.87%，重現(xiàn)性好。本法測(cè)定操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于發(fā)酵液中胞二磷膽堿鈉含量的測(cè)定。

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