FKBP52在反復(fù)體外受精種植失敗患者種植窗期子宮內(nèi)膜的表達(dá)研究

譚真，彭麗英，朱文杰，賴寶玲，付志紅，李雪梅，唐雪蓮

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院，深圳 518048）

提高胚胎種植率是體外受精（IVF）助孕技術(shù)的一大挑戰(zhàn)。胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎種植的兩大重要因素，尋求預(yù)測(cè)與評(píng)估子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性的客觀方法，有助于減少胚胎移植的盲目性［1］。近年來使用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)描繪了胚胎種植窗期人子宮內(nèi)膜的基因和蛋白的表達(dá)圖譜，為使用生化標(biāo)志物預(yù)測(cè)種植期子宮內(nèi)膜容受性提供了有利條件。

已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52與孕激素受體（PR）結(jié)合能大大提高孕酮（P）與PR的親和力，增強(qiáng)PR活性，尤其是種植窗期FKBP52在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)空特異性［2－3］。Tranguch等［4－5］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52基因敲除小鼠胚胎植入完全失敗，提示FKBP52是影響胚胎植入和子宮內(nèi)膜容受性的非常重要的蛋白。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)FKBP52的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，且FKBP52在種植期的細(xì)胞定位和定量表達(dá)尚不明確。本研究檢測(cè)FKBP52蛋白在人子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況，探討其與人子宮內(nèi)膜容受性之間的關(guān)系，為臨床提高胚胎種植率提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2013年8月至2014年3月在我院生殖中心接受體外受精－胚胎移植（IVF－ET）治療、連續(xù)3周期并移植至少6個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲得臨床妊娠者20例（研究組）。同期募集正常女性志愿者15例（對(duì)照組），要求其近年有正常生育史，無卵巢手術(shù)史，3個(gè)月內(nèi)無激素治療及宮腔操作史；無子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、子宮肌瘤、子宮腺肌瘤或多囊卵巢綜合征等疾病。所有參與者年齡25～35歲，月經(jīng)規(guī)律，基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，B超顯示正常子宮形態(tài)，卵泡晚期內(nèi)膜三線征明顯，厚度≥8mm。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者簽署知情同意書。

二、研究方法

1.監(jiān)測(cè)排卵和分組：入組者于月經(jīng)第10天開始陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，至卵泡直徑達(dá)15mm以上時(shí)，每天檢測(cè)卵泡大小及尿黃體生成素（LH）峰監(jiān)測(cè)排卵，尿LH峰日為卵泡晚期，排卵＋7d為種植窗期，收取研究組婦女種植窗期子宮內(nèi)膜標(biāo)本（組1），并分別收取對(duì)照組卵泡晚期（組2）和種植窗期（組3）的子宮內(nèi)膜標(biāo)本。

2.標(biāo)本采集和處理方法：用直徑0.3cm的內(nèi)膜取樣器（GYNETICS，比利時(shí)）采集子宮腔中段內(nèi)膜標(biāo)本，置于4℃生理鹽水，洗去血污，干紗布?jí)K吸去水分后分成2份：1份迅速放入－80℃冰箱中保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）檢測(cè)；1份放入4%甲醛中固定，用于免疫組織化學(xué)測(cè)定，同日抽血測(cè)定血清雌二醇（E2）和孕酮（P）水平。

3.RT－PCR檢測(cè)：采用 Trizol試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）提取子宮內(nèi)膜組織總RNA，并測(cè)量其RNA濃度及純度，控制A260／A280在1.8～2.0范圍。采用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Fermentas，加拿大）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取總RNA 2μg，OligodT18 1μl逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積20μl。FKBP52引物序列：上游 5′－CATTGCCATAGCCACCATGAA－3′，下游5′－TCCAGTGCAACCTCCACGATA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度252bp。同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參，其引物序列上游為5′－CAAGGTCATCCATGACAACTTTG－3′，下游為5′－GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度475bp，引物均由南京金思瑞公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃3min預(yù)變性，94℃20s變性，59℃20s退火，72℃30s延伸，共40個(gè)循環(huán)。監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)，自動(dòng)計(jì)算軟件融點(diǎn)曲線分析，采用ABI7300型PCR儀（ABI，美國(guó)）檢出結(jié)果。按下列公式計(jì)算樣本中FKBP52mRNA 的相對(duì)表達(dá)量［6］：△Ct（目的基因）＝Ct（目的基因）－Ct（內(nèi)參基因）；△△Ct＝△Ct（待測(cè)樣本）－△Ct（參照樣本）；目的基因的相對(duì)表達(dá)量為2－△△Ct。

4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)：標(biāo)本按常規(guī)脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行包埋成石蠟塊。采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連接法（SP法）檢測(cè)FKBP52蛋白的表達(dá)及定位。操作方法按SP法試劑盒（北京中杉金橋）說明書進(jìn)行。石蠟切片厚3μm，常規(guī)脫蠟、水化、封閉，滴加一抗。一抗為兔抗人FKBP52多克隆抗體（Abcam，英國(guó)），工作稀釋度1∶100，4℃冰箱過夜。再滴加羊抗兔IgG（SP－9001，北京中杉金橋）二抗，3，3′－二氨基聯(lián)苯胺（DAB，武漢博士德）顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹膠封片。陽性表達(dá)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿染成黃色或棕黃色。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。每張切片在顯微鏡（Olympus，日本）下隨機(jī)選取互不重復(fù)的5個(gè)視野（×400倍），采用Image－proplus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定每個(gè)視野的積分光密度值（IOD），求其平均值，記為FKBP52蛋白的表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組的一般情況比較

對(duì)照組（組2、3）和研究組（組1）的平均年齡、體重指數(shù)（BMI）、月經(jīng)周期、基礎(chǔ)的卵泡刺激素（FSH）、LH、E2、P、泌乳素（PRL）和睪酮（T）及黃體期的E2、P水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為 0.463、0.618、0.809、0.404、0.328、0.504、0.517、0.660、0.187、0.664和0.305）（表1）。

表1 對(duì)照組和研究組的一般情況（±s）

表1 對(duì)照組和研究組的一般情況（±s）

組 別 例數(shù) 平均年齡（歲） BMI（kg／m2） 月經(jīng)周期（d）基礎(chǔ)性激素水平FSH（U／L） LH（U／L）對(duì)照組 15 32.7±2.9 21.91±2.63 31.0±3.7 7.48±1.63 4.53±1.77研究組 20 33.3±3.1 22.17±2.40 31.3±3.0 7.79±1.44 4.05±1.64組 別 例數(shù)基礎(chǔ)性激素水平 黃體期激素水平E2（pmol／L） P（nmol／L） PRL（nmol／L） T （nmol／L） E2（pmol／L） P（nmol／L）對(duì)照組 15 179.93±65.40 2.38±1.49 9.88±3.30 1.25±0.45 859.37±200.57 70.31±26.09研究組 20 157.97±77.96 2.16±1.43 15.46±7.71 1.39±0.45 811.42±278.49 60.77±20.26

二、FKBP52mRNA的表達(dá)情況

在實(shí)驗(yàn)過程中，采用RT－PCR檢測(cè)，在三組中均有FKBP52mRNA表達(dá)，F(xiàn)KBP52基因和內(nèi)參基因GAPDH的溶解曲線峰均為特異的單峰，熔點(diǎn)溫度（波峰對(duì)應(yīng)的溫度）分別為85.7℃和88.5℃，表明擴(kuò)增產(chǎn)物有特異性。組1的平均FKBP52mRNA表達(dá)水平低于組3，組2的FKBP52mRNA表達(dá)值亦低于組3，但三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 不同組FKBP52mRNA表達(dá)量及蛋白IOD值結(jié)果（±s）

表2 不同組FKBP52mRNA表達(dá)量及蛋白IOD值結(jié)果（±s）

注：與組3比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù) FKBP52mRNA FKBP52蛋白IOD值1 20 1.85±1.01 2 125.9±1 729.9＊2 15 2.29±2.13 1 360.2±853.7＊＊3 15 3.38±3.14 8 319.7±5 873.8

三、FKBP52蛋白的表達(dá)及定位情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP52蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮的胞核及胞漿，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極少。組1以胞核表達(dá)明顯（圖1A），組2以胞漿表達(dá)明顯（圖1B），組3中胞核及胞漿均表達(dá)明顯（圖1C）。Image－proplus6.0軟件圖像分析結(jié)果，組3的平均IOD值顯著大于組1（P＜0.05）和組2（P＜0.01）（表2）。

四、FKBP52mRNA及蛋白的表達(dá)與黃體期E2、P的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜FKBP52 mRNA的表達(dá)與雌、孕激素水平無相關(guān)性（r＝0.340，P＝0.436；r＝0.201，P＝0.413），F(xiàn)KBP52蛋白的表達(dá)與雌、孕激素水平也無相關(guān)性（r＝0.283，P＝0.367；r＝0.240，P＝0.394）（表3）。

圖1 FKBP52蛋白在3組的表達(dá)情況（SP法＋蘇木素復(fù)染 ×400）

表3 種植窗期FKBP52表達(dá)量與E2、P的關(guān)系

討 論

在IVF－ET過程中，常常好的胚胎質(zhì)量、好的內(nèi)膜、好的激素水平情況下仍然會(huì)發(fā)生不明原因的反復(fù)種植失敗，而對(duì)之臨床上依然缺乏有效的解決手段。近年來從分子生物學(xué)角度探尋其中關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)以作為標(biāo)志物，旨在指導(dǎo)臨床成為目前研究的熱點(diǎn)。

自1985年第1次發(fā)現(xiàn)FKBP52蛋白以來，越來越多的研究者重視FKBP52的研究。Lebeau等［7］研究發(fā)現(xiàn)，從兔肝臟中克隆出FKBP52的cDNA序列，能使FKBP52結(jié)合甾體激素受體，調(diào)節(jié)激素受體功能，增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。Dey等［8］研究發(fā)現(xiàn)，缺少PR的小鼠可見排卵、受精和種植失敗，但在FKBP52基因敲除的小鼠僅由于缺乏子宮內(nèi)膜容受性而引起種植失敗。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜FKBP52在“種植窗”前期和“種植窗”期的表達(dá)存在差異［9］。FKBP52在子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性起著重要作用，不管動(dòng)物還是人類，相繼得到了證明。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜上FKBP52的表達(dá)的相關(guān)因素進(jìn)行研究，以正常婦女“種植窗”前期和“種植窗”期為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)“種植窗”前期和“種植窗”期FKBP52蛋白均有表達(dá)，其主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮的胞核及胞漿，間質(zhì)細(xì)胞幾乎無表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，胚胎植入過程中FKBP52首先定位于胞漿，與PR結(jié)合形成復(fù)合物，再由胞漿內(nèi)的動(dòng)力蛋白快速轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核與P結(jié)合調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)［10］。本研究顯示，正常婦女子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白于胞漿和胞核均有表達(dá)，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致；而反復(fù)體外受精種植失敗患者種植窗期FKBP52蛋白的表達(dá)僅定位于胞核，有別于正常的定位模式，或許這是不能成功種植的原因之一。

本組免疫組化結(jié)果還顯示，反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白的表達(dá)顯著低于正常育齡婦女，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胚胎種植是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，這一過程在特定的時(shí)空范圍內(nèi)發(fā)生，即“種植窗”。種植窗期一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子等復(fù)雜而又精確的定位和變化以及胚胎與子宮內(nèi)膜容受性之間非?？b密的對(duì)話機(jī)制是胚胎成功植入的關(guān)鍵［11］。本研究結(jié)果提示，反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白的異常定位及低表達(dá)可能影響了胚胎與子宮內(nèi)膜之間的精密對(duì)話，從而導(dǎo)致種植失敗，但其具體影響機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。RT－PCR檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致，從不同側(cè)面反映了FKBP52表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性的緊密相關(guān)性，推測(cè)FKBP52表達(dá)異常是胚胎種植失敗的重要相關(guān)因素。而FKBP52表達(dá)與血清雌孕激素高低無顯著相關(guān)性，今后應(yīng)加大研究的樣本量，并需進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜雌孕激素受體與FKBP52蛋白表達(dá)之間關(guān)系，以對(duì)結(jié)論作進(jìn)一步驗(yàn)證。

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