恐懼應(yīng)激大鼠行為學(xué)評估及比較*

董秋安 劉曉偉

（同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院·上海 200065）

隨著社會發(fā)展的加快，競爭壓力逐步增大，人類疾病譜發(fā)生了很大的變化，各種因社會、心理或行為因素所致疾病急劇上升，心理過度應(yīng)激導(dǎo)致的精神類疾病層出不窮。有資料顯示，我國70%的人處于亞健康狀態(tài)，與心理應(yīng)激相關(guān)的疾病患者約占人群的5%～10%，身心疾病、心理障礙已成為多發(fā)病、常見病。目前，對心理疾病及心理應(yīng)激的基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究重要課題之一。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)七情理論，參照Takashi[1]方法建立恐懼應(yīng)激模型，觀察并評估其行為學(xué)變化，為探索中醫(yī)情志病證模型制作的思路與方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性Wistar大鼠，體重180～220g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物合格證號：粵檢證字2002A041號）。室溫22～26℃安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。動物分組：正常對照組、恐懼模型組、孤獨(dú)飼養(yǎng)組，每組8只。

1.2 模型制作方法

恐懼模型組：大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于不銹鋼籠中（50cm×30cm×20cm），自由飲食飲水，飼養(yǎng)10天，第11天13：30將大鼠單獨(dú)放入光電刺激儀（30cm×40cm×40cm），四周為玻璃，底部鋪設(shè)銅柵，通以1mA交流電，頂部置10W日光燈）；前5min為適應(yīng)期，后同時給予電擊和閃光，每次1S，間隔1min，共30次。第12，13天重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第14天實(shí)驗(yàn)只予光照，不予電擊，攝像記錄第6min－30min內(nèi)大鼠行為變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束立即放入曠場實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測。

孤獨(dú)飼養(yǎng)組：大鼠于同樣環(huán)境下孤獨(dú)飼養(yǎng)10天，第14天13：30攝像記錄大鼠行為變化，并對其行為學(xué)進(jìn)行評分，14：00放入曠場實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測。

同樣環(huán)境下，正常對照組大鼠予以群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，第14天進(jìn)行行為學(xué)測定及曠場實(shí)驗(yàn)，步驟及時間同孤獨(dú)飼養(yǎng)組。本實(shí)驗(yàn)中動物抓取要求動作特別輕柔，避免不必要的刺激干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 試劑和儀器

SONY.DCR-TRV9E數(shù)碼攝像機(jī)（日本），曠場實(shí)驗(yàn)箱（100cm×100cm×50cm）。

1.4 行為學(xué)變化觀察

恐懼模型組大鼠行為學(xué)檢測[2]：恐懼模型組大鼠在閃光照射后出現(xiàn)凍結(jié)姿勢（freezingposture）：靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動。其總時間稱為凍結(jié)時間（freezingtime），即恐懼模型組大鼠行為得分。行為評定采用盲法，單位以秒來計(jì)算，由3名觀察者觀看錄像后評分，取其平均值。三者評定一致性很高（大于0.95）。

應(yīng)激后曠場行為學(xué)檢測[3]：將動物置于100cm×100cm×50cm，周壁為黑色，底面分成面積相等的25方格的曠場里。攝像記錄動物3min的行為，以穿越底面的格子數(shù)為水平活動得分，以直立的次數(shù)為垂直活動得分，曠場實(shí)驗(yàn)得分為兩者之和。行為評定采用盲法，由3名觀察者觀看錄像后評分，取其平均值。三者評定一致性很高（大于0.95）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，均用X—±s表示，利用Pearson相關(guān)分析曠場兩變量之間的關(guān)系，采用單因素方差分析方法（One-Way-ANOVA）進(jìn)行多樣本均數(shù)比較，若存在差異，采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差一致性檢驗(yàn)，若方差齊時，用Least-significantdifference（LSD）方法，若方差不齊時用Tamhane’sT2方法。P＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

1.各組大鼠行為學(xué)得分

實(shí)驗(yàn)開始5min為適應(yīng)期，恐懼模型組大鼠移動緩慢、貼壁，后蜷縮于角落處。接受閃光照射后表現(xiàn)為靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等凍結(jié)姿勢，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動；伴有立毛、肌肉輕微振顫、大小便失禁。三組間行為學(xué)得分存在顯著差異（F=72.582，P=0.000），恐懼應(yīng)激大鼠行為學(xué)得分高于正常對照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組（P=0.000）。正常對照組與孤獨(dú)飼養(yǎng)組比較，無顯著差異（P=0.153）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)得分比較（秒，X—±s）Table1：Comparison of praxiology score of each group

2 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為學(xué)得分

各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)得分比較結(jié)果：各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分、曠場總分均有顯著差異（P＜0.01）。水平得分、垂直得分、曠場總分F值分別為23.893、52.371、40.963；P值均為0.000?？謶帜Ｐ徒M得分低于孤獨(dú)飼養(yǎng)組和正常對照組，孤獨(dú)飼養(yǎng)組得分高于恐懼模型組，低于正常對照組（均為P＜0.05）。對垂直得分及水平得分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.730，P＝0.000（雙側(cè)），認(rèn)為水平得分與垂直得分之間存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為學(xué)得分比較（分，Table2：Comparison of open-field score of each group

表2 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為學(xué)得分比較（分，Table2：Comparison of open-field score of each group

注：與正常對照組相比（vs normal group）：*P＜0.05；與恐懼模型組相比（vsmodelgroup）：#P＜0.05

組別 N 水平得分 垂直得分 曠場實(shí)驗(yàn)得分正常對照組 8 32.38±9.04# 8.50±1.20# 40.88±9.54#恐懼模型組 8 10.00±3.21* 1.38±0.74* 11.38±3.07*孤獨(dú)飼養(yǎng)組 8 24.63±6.14*# 5.13±2.00*#29.75±5.44*#F 23.893 52.371 40.963 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

恐志屬中醫(yī)七情范疇，對恐志的基礎(chǔ)及臨床研究為七情學(xué)說的重要內(nèi)容。但是由于目前對情感因素有關(guān)的腦區(qū)定位尚未完全明確，又缺乏相關(guān)的動物模型，故目前涉及怒、恐在內(nèi)的情志基礎(chǔ)研究報道并不多。Davis[4][5]發(fā)現(xiàn)通過條件反射性恐懼訓(xùn)練（Contextual fear conditioning）的動物，其行為表現(xiàn)與臨床焦慮癥患者的癥狀和體征很相似。恐懼條件反射[6]是指在一種明確的中性刺激（一般是光照或聲音）與一種惡性刺激（通常是電擊足底）之間建立聯(lián)系，這種聯(lián)系建立與否可以用木僵行為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。Davis等[6]認(rèn)為，燈光與電擊足部引起的驚嚇反應(yīng)增強(qiáng)是一種刺激特異性恐懼。目前條件性恐懼訓(xùn)練已經(jīng)成為一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮恐懼反應(yīng)模型的方法，被國外學(xué)者所采用。本試驗(yàn)根據(jù)經(jīng)典條件反射原理，試圖制作恐懼心理應(yīng)激動物模型，并對模型進(jìn)行了量化評定。實(shí)驗(yàn)中的恐懼模型根據(jù)Takashi[1]方法并改良，通過間斷、低頻、低壓交流電電擊大鼠足底，使動物反復(fù)受到刺激，結(jié)合同步閃光照射，3天后形成條件反射。第4天僅給予閃光照射，大鼠即產(chǎn)生恐懼心理和行為，表現(xiàn)為長時間的靜止或蜷臥等。凍結(jié)姿勢能夠客觀、有效地反映動物的恐懼情緒水平，其總時間測定與文獻(xiàn)報道基本一致[7]。本實(shí)驗(yàn)恐懼應(yīng)激大鼠的行為得分與正常對照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組比較均有顯著差異（F=72.582，P=0.000）,恐懼應(yīng)激大鼠行為學(xué)得分顯著高于正常對照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組，而正常對照組與孤獨(dú)飼養(yǎng)組比較，無顯著差異（P=0.153），說明造模大鼠恐懼情緒水平較高，而單純的孤獨(dú)飼養(yǎng)并無此效果。

中醫(yī)七情理論系統(tǒng)闡述了情緒致病的機(jī)理：主要通過擾亂人體的氣機(jī)升降，導(dǎo)致五臟的氣機(jī)失調(diào)而發(fā)病?！秲?nèi)經(jīng)》中言：“百病先于氣也，怒則氣上，恐則氣下”“憂恐忿怒傷氣，氣傷臟，乃病證”等，即憤怒、恐懼等情緒，先傷人體的氣機(jī)，由氣機(jī)的紊亂進(jìn)而使五臟受病。“有諸內(nèi)者，必形諸外”，行為是臟腑氣血的外在反映。憤怒、驚恐等情緒在內(nèi)擾亂氣機(jī)而致病，在外則表現(xiàn)為行為異常?？謶种饕憩F(xiàn)為退縮逃避、驚慌失措、交感神經(jīng)興奮（呼吸心跳加快、瞳孔擴(kuò)大、顫抖），甚至肢體軟癱、大小便失禁或精神抑制等[7]。

曠場實(shí)驗(yàn)是比較經(jīng)典的用于反映動物探究行為及情緒反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法，能夠有效評價動物對新異環(huán)境的興奮性、適應(yīng)性、探究、緊張、記憶等多種行為。水平得分即動物跨格數(shù)，反映動物的興奮性；垂直得分即動物站立次數(shù)，主要反映動物對周圍環(huán)境的不確定性和探究趨勢。這種活動在一定程度上表明了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分、曠場總分均有顯著差異（F值分別為23.893、52.371、40.963；P值均為0.000）。恐懼模型組得分顯著低于孤獨(dú)飼養(yǎng)組和正常對照組，孤獨(dú)飼養(yǎng)組得分顯著高于恐懼模型組，低于正常對照組（P＜0.05），說明排除孤獨(dú)飼養(yǎng)因素，恐懼應(yīng)激能夠使大鼠的興奮性、敏感性明顯減弱。曠場實(shí)驗(yàn)水平得分與垂直得分呈顯著正相關(guān)（r=0.730，P=0.000），說明反映動物相同功能的兩指標(biāo)對應(yīng)良好，實(shí)驗(yàn)的可靠性強(qiáng)。

公認(rèn)良好有效的情感障礙動物模型應(yīng)該具有以下特征[8]：行為表現(xiàn)的模擬性（模型與疾病之間癥狀的一致性）；藥效的可預(yù)測性；具有合理的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的恐懼應(yīng)激動物模型盡可能排除軀體刺激的干擾，為相對“純粹”的情緒模型；后期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用藥物進(jìn)行藥效預(yù)測[9]；同時對動物的行為進(jìn)行量化評分，更為客觀準(zhǔn)確。經(jīng)曠場實(shí)驗(yàn)分析，恐懼則減弱大鼠興奮性及適應(yīng)能力，這種表現(xiàn)與人的情緒反應(yīng)有一定程度的相似性，說明此模型能夠有效模擬人類恐懼情緒，排除軀體刺激干擾，且量化評定方法直觀、可靠，是較為理想的中醫(yī)情志內(nèi)傷模型。

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