抗原修復(fù)時間對陳舊性乳腺癌核抗原表達的影響

李霞斌，劉 俊，蔣 堃

乳腺癌是世界婦女發(fā)病率占第一位的惡性腫瘤，近年我國乳腺癌發(fā)病率持續(xù)上升，每年增長3～4個百分點，并呈明顯的年輕化趨勢［1］。國內(nèi)外專家建議對所有原發(fā)和復(fù)發(fā)乳腺癌標本進行ER 和PR表達水平檢測，作為選擇臨床治療方案和輔助內(nèi)分泌治療的依據(jù)。ER 和PR 作為乳腺癌內(nèi)分泌治療療效的重要預(yù)測標記，其檢測結(jié)果的準確性是臨床選擇治療方案的重要依據(jù)［2-3］。Ki-67 反映腫瘤細胞的增殖活性而與乳腺癌輔助治療反應(yīng)有關(guān)［4］。ER、PR及Ki-67的檢測在乳腺癌個體化內(nèi)分泌治療中的應(yīng)用已成為臨床不可或缺的依據(jù)。

免疫組織化學(xué)法因操作簡便、重復(fù)性好、成本低廉等優(yōu)勢，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)。但據(jù)最新資料統(tǒng)計，目前ER、PR 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果的假陽性和假陰性率高達20%［4］。在臨床和回顧性研究工作中我們常遇到一些會診和時隔幾年后進行乳腺癌免疫組化檢測的病例。對于陳舊性乳腺癌石蠟標本，按照新鮮蠟塊修復(fù)方法檢測結(jié)果常不理想，有些抗原常檢測不出，或僅呈弱陽性，特別是核抗原。為了給臨床和科研提供真實可靠的信息，我們對陳舊性乳腺癌標本主要核抗原ER、PR、Ki-67 的修復(fù)方法進行探索。

1 材料與方法

1.1 檢測組織 隨機選取瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2010 年1 月～2011 年12 月浸潤性乳腺癌石蠟標本120例。

1.2 試劑 兔抗人ER、PR單克隆抗體（克隆號：SP1、SP2，福建邁新），鼠抗人Ki-67 單克隆抗體（克隆號：MIB-1）、即用型Envision檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液均購于丹麥DAKO公司。

1.3 實驗方法 石蠟標本3μm 連續(xù)切片，60℃烤箱烤片4h，二甲苯脫蠟后梯度酒精至水。切片置于EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液中：（1）高壓修復(fù)：高壓鍋加蒸餾水加熱至沸騰，將切片放入盛修復(fù)液的修復(fù)盒內(nèi)蓋上加壓閥，繼續(xù)加熱至噴氣，分別維持噴氣時間5、10、15、20min后立刻離開熱源，自然冷卻至室溫。（2）水浴修復(fù)：切片放入盛有修復(fù)液的修復(fù)盒，之后放入沸水浴鍋內(nèi)，修復(fù)30min 后離開熱源，自然冷卻至室溫。3%甲醇雙氧水封閉過氧化物酶10min。一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育30min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果分析 ER、PR 和Ki-67 陽性物質(zhì)均定位于腫瘤細胞核，每張切片隨機選取10個高倍視野（40×）計數(shù)陽性細胞數(shù)，采用陽性表達率半定量分級標準：（1）ER/PR 陽性定義為：＜1%為（-），1%～33%為（1+），34%～66%為（2+），＞66%為（3+）；（2）Ki-67 腫瘤細胞陽性率＜10%為（-），10%～50%為（1+），51%～75%為（2+），＞75%為（3+）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同修復(fù)時間對ER、PR 和Ki-67 染色抗原表達的影響 切片經(jīng)15、20min 高壓修復(fù)和水浴30min修復(fù)后，ER、PR的陽性表達較理想，細胞核陽性著色強且背景干凈，細胞質(zhì)和間質(zhì)中無非特異性著色；著色時間在20min 組最短，15min 高壓修復(fù)和30min 水浴修復(fù)組著色時間部分切片稍有延長、染色強度稍有減弱；修復(fù)5、10 min 組ER、PR 部分切片僅組織邊緣有陽性細胞，陽性著色深淺不一，染色時間也稍長。Ki-67 抗原的表達在15、20min 修復(fù)條件下表達較理想，染色均勻無背景染色；在高壓修復(fù)5、10 min 和水浴30min 的情況下染色均不理想，著色不均勻更明顯，部分腫瘤細胞染色呈淺黃色，模糊難以判斷。對于修復(fù)時間＞10min的切片，部分切片的脂肪成分有輕微掉片現(xiàn)象，但腫瘤組織保存較好，不影響結(jié)果判讀。

2.2 不同抗原修復(fù)時間對癌細胞ER、PR 和Ki-67 陽性率的影響 隨修復(fù)時間的延長總陽性率由高到低依次是：20min、15min、水浴30min、10min、5min，且20min 組高級別陽性率最高。ER、PR 在修復(fù)時間＞15min陽性率明顯提高。Ki-67在高壓修復(fù)15、20min陽性率較水浴30min 及高壓修復(fù)5min、10min 明顯提高。ER、PR、Ki-67在20min組陽性信號強，陽性率最高，與5、10min 組差異有顯著性（P＜0.05），與其余各組比較差異無顯著性（P＞0.05），但高壓20min和水浴30min 比較Ki-67 的表達較ER、PR 的表達差異更明顯。經(jīng)不同時間修復(fù)各指標在乳腺癌的陽性表達，見表1。

表1 ER、PR、Ki-67在不同修復(fù)時間下的表達（n=120）

3 討論

組織在固定過程中，經(jīng)甲醛、加熱、有機溶劑等處理使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)、變性，其抗原決定簇被封閉而無法表達?？乖瓫Q定簇的充分暴露是決定免疫組織化學(xué)結(jié)果的關(guān)鍵［5］。有研究發(fā)現(xiàn)與空氣接觸的切片在室溫下保存3個月以上，免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性；抗原對多數(shù)抗體的敏感性下降50%，部分切片保存6個月多數(shù)抗體做不出陽性結(jié)果，尤其核表達抗原丟失更為突出，其原因可能與氧化作用有關(guān)［6］。對于陳舊性石蠟組織，在保存過程中雖然表面有封蠟，但不是完全的真空狀態(tài)，氧化作用不可避免，可能會導(dǎo)致部分抗原的丟失，特別是淺表組織；同時存放時間越長其抗原決定簇被封閉時間也越長，要將其暴露也越不容易，特別是核抗原的暴露，也許這就是大部分陳舊性蠟塊抗原表達差的原因之一。

目前認為影響核抗原暴露的主要因素有抗原修復(fù)液的pH 值、修復(fù)溫度、壓力、持續(xù)時間［7］。日常免疫組化工作中對于核抗原，大家逐漸選用高pH 值修復(fù)液進行高壓修復(fù)［8］。只有達到一定的溫度和時間，抗原暴露充分，染色效果才好。在本實驗中我們均采用pH9.0 的EDTA 修復(fù)液，比較不同高壓修復(fù)時間之間以及高壓修復(fù)與水浴修復(fù)間的差異，發(fā)現(xiàn)隨著高壓修復(fù)時間的延長，抗原表達逐漸增強，20min 的高壓修復(fù)是陳舊性乳腺癌蠟塊主要核抗原表達的最佳修復(fù)條件；而水浴修復(fù)的時間雖長，但其效果和短時間的高壓修復(fù)差不多，對于Ki-67 抗原的表達尤其明顯。究其原因可能是修復(fù)時間的延長能使抗原決定簇暴露更加充分，有利于抗原、抗體更好結(jié)合；熱修復(fù)時間延長還能洗脫部分大分子抗原，降低背景著色［9］。另一方面高壓加熱的溫度可達到120℃，而水浴修復(fù)在有一定海拔高度的地方很難達到100℃，組織在120℃的高溫下維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的氨基酸側(cè)鏈基團的次級鏈斷裂，產(chǎn)生更多有功能的特征性蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，暴露了更多的抗原結(jié)合點［10］。對于長時間高溫高壓修復(fù)可能出現(xiàn)的脫片、非特異性背景染色等不良后果，隨著載玻片防脫技術(shù)的不斷改進，只有小部分組織有脫片現(xiàn)象，而且隨著抗體和免疫組化檢測系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，背景染色也鮮有出現(xiàn)。

不同的抗體其最佳修復(fù)條件存在差異，但是通過摸索可尋求它們的共同最佳修復(fù)條件，在實際工作中節(jié)省時間。對于陳舊性乳腺癌石蠟標本，我們在日常免疫組化工作中應(yīng)該區(qū)別對待，盡可能的為臨床提供真實可靠的信息；在科研工作中，也應(yīng)本著求真務(wù)實的精神，不斷探索最佳實驗條件，提供詳實的數(shù)據(jù)。通過本實驗，對于存放時間稍長的乳腺癌石蠟包埋組織，我們認為應(yīng)采用EDTA（pH9.0）高壓修復(fù)20min，讓抗原如實表達。

［1］韓艷清，李卓，李文紅，等.乳腺癌發(fā)病趨向及X射線攝影普查的研究［J］.中國醫(yī)學(xué)裝備，2013，10（12）：11-13.

［2］Hammond M E H，Hayes D F，Dowsett M，et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer［J］.J Clin Oncol，2010，6（4）：195-197.

［3］代瑩，傅靜，魏兵，等.經(jīng)他莫昔芬治療的乳腺癌ER、PR 陽性率和染色強度與預(yù)后的關(guān)系［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29（4）：419-423.

［4］陳守菊，劉福川.乳腺癌ER、PR、PS2、C-erbB2，Ki-67 聯(lián)合檢測的臨床意義［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（9）：653-654.

［5］Shi S R，Shi Y，Taylor C R.Antigen retrieval immunohistochemistry review and future prospects in research and diagnosis over two decades［J］.J Histochem Cytochem，2011，59（1）：13-32.

［6］王麗，張秋金，林齊心.初論免疫組化標準化（一）［J］.診斷病理學(xué)雜志，2005，10（5）：310-311.

［7］蔣潔，羅志飛，藍永洪，等.免疫組化染色中核抗原暴露的優(yōu)化［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，19（6）：728-730.

［8］林齊心，陳贊烽，熊玉林.抗原修復(fù)條件的變化對Ki-67 免疫組化染色的影響［J］.診斷病理學(xué)雜志，2012，19（6）：37.

［9］杜娟，石雪迎，鄭杰，等.抗原修復(fù)液pH 值及修復(fù)時間對免疫組化染色效果的影響［J］.北京大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，37（2）：195-197.

［10］沈溪明，何欣欣，吳東霞，等.甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子TTF21抗原修復(fù)方法的探討［J］.診斷病理學(xué)雜志，2007，14（2）：153.