飛秒激光直寫生物凝膠模板原位合成納米粒子

劉東旭，夏 虹，孫允陸，陳岐岱，董文飛

(吉林大學(xué)集成光電子國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130012)

1 引言

聚合物微結(jié)構(gòu)在光子學(xué)［1］、微流變學(xué)［2］、組織工程［3］和生物分子分析工程［4］等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。它們的性能與其形狀，尺寸以及化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。例如，作為載體應(yīng)用于載藥工程的聚合物顆粒［5］，其流動(dòng)性，分解性和被吞噬能力取決于它們的幾何形狀和尺寸［6］。通過改變聚合物結(jié)構(gòu)的形狀和組分［7-9］，可以高效地修飾其擴(kuò)散、懸浮流變性、自組裝等特性。因此，亟須開發(fā)新型制備工藝來實(shí)現(xiàn)具有不同形狀和化學(xué)性能的聚合物微結(jié)構(gòu)［10-11］，如低表面粗糙度及三維任意可控幾何形狀的聚合物微納結(jié)構(gòu)。采用拉伸聚合物微結(jié)構(gòu)［12］、非浸潤模板的復(fù)制［13］、光刻［14］和微流體［2，15］等傳統(tǒng)方法，能夠連續(xù)制備具有多種形貌和化學(xué)性質(zhì)的聚合物微結(jié)構(gòu)。然而這些方法往往只局限于簡單的規(guī)則圖形或二維結(jié)構(gòu)，如何實(shí)現(xiàn)聚合物微結(jié)構(gòu)的三維加工是相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

飛秒激光直寫是一種新興的先進(jìn)微加工方法，基于多光子吸收原理，它可以制備任意復(fù)雜形狀和低于衍射極限尺寸的三維結(jié)構(gòu)［16］。因此，其在聚合物微加工中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。然而，由于聚合物修飾組分的加入(如加工溶液中混有固態(tài)的功能性納米粒子)，會(huì)導(dǎo)致激光在聚焦區(qū)域的散光，嚴(yán)重影響加工效果。

為了解決以上問題，本文介紹了一種飛秒激光直寫與原位納米粒子合成相結(jié)合的方法，先由飛秒激光直寫摻有功能液體組分的加工溶液，制備出具有特定結(jié)合位點(diǎn)的水凝膠模板，然后進(jìn)行原位納米粒子合成，成功制備了具有幾十μm量級(jí)尺寸和10 nm量級(jí)粗糙度同時(shí)具有三維復(fù)雜形貌和特定化學(xué)性質(zhì)的水凝膠微結(jié)構(gòu)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所需試劑:低聚物聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=575 g/mol)，丙烯酸(AA)和光引發(fā)劑亞甲基藍(lán)(MB)，Tween 20購自美國 Sigma-Aldrich公司，F(xiàn)eCl3，AgNO3，NaOH，氨水(NH4OH)購自北京化工有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用超純水由Threestage Milli-Q Plus 185系統(tǒng)凈化，電阻率為18.2 MΩ·cm。所有化學(xué)品均直接使用，不需要進(jìn)一步提純。

實(shí)驗(yàn)所需儀器:鈦藍(lán)寶石飛秒激光振蕩器Femtosecond laser(Spectra Physics 3960-X1BB)，泵浦光源波長532 nm，功率7.3 W，穩(wěn)定輸出功率1.4 W，重復(fù)頻率 80 MHz，輸出脈沖 120 fs，波長800 nm，單脈沖能量20 nJ。緊聚焦油浸加工物鏡，NA=1.35，60×。壓電平臺(tái) PZT(Physik InstrumenteP-622ZCD)。數(shù) 字 攝 像 頭 CCD(DV100，10 Moons)。

2.2 飛秒激光加工原理

飛秒激光加工基于多光子吸收原理，主要為雙光子吸收過程。這一過程的預(yù)言首先由Maria GEppert-Mayer在 1931 年從理論上提出［17］，其取決于光強(qiáng)度的非線性。發(fā)生多光子吸收的基本條件是一次吸收兩個(gè)或更多的光子，因此可以通過一個(gè)緊聚焦的油浸顯微物鏡將超快激光光束匯聚，焦點(diǎn)體積內(nèi)的材料發(fā)生光化學(xué)或光物理過程而進(jìn)行局域化的轉(zhuǎn)變。通過移動(dòng)焦點(diǎn)在材料中的位置可以實(shí)現(xiàn)三維加工。此外，調(diào)節(jié)加工閾值能夠使加工精度突破衍射極限，從而達(dá)到亞100 nm的分辨率。

2.3 生物凝膠模板的制備

圖1 實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Scheme of the laser fabrication

如圖1所示，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.5%聚乙二醇二丙烯酸酯，12.5%丙烯酸，0.075%亞甲基藍(lán)溶于超純水中，在25℃的水浴中超聲5 min，使得所有的化學(xué)組分分散均勻，制成激光加工預(yù)聚物溶液。然后用量程為100 μL的移液槍量取20 μL預(yù)聚物溶液滴于24 mm×50 mm規(guī)格的蓋玻片上。在使用前此蓋玻片需經(jīng)過嚴(yán)格的清洗。先是用丙酮、乙醇、去離子水各清洗15 min，然后在烘干箱中烘干5 min，并在蓋玻片上用無色玻璃膠圈出5 mm×5 mm大小的區(qū)域，方便固定加工溶液以及后期表征。

將緊聚焦油浸加工物鏡(NA=1.35，60×)固定在壓電平臺(tái)底部，用注射器吸取松柏油滴在加工物鏡鏡頭上，然后將有加工預(yù)聚物溶液的蓋玻片放在壓電平臺(tái)上，調(diào)節(jié)Z軸方向的機(jī)械旋鈕，使得蓋玻片與鏡頭之間的距離適中，方便調(diào)節(jié)激光光斑。選取適當(dāng)?shù)募す饧庸?shù)，制備出生物凝膠模板。

2.4 原位合成納米粒子

如圖1所示，將激光加工后的蓋玻片取下，用擦鏡紙擦去蓋玻片底部的松柏油，然后置于60 mm×30 mm規(guī)格的稱量瓶中(由于加工后的結(jié)構(gòu)聚合成固體，相當(dāng)于光刻膠中的負(fù)膠，因此洗去未聚合溶液的過程稱為顯影)，在去離子水中顯影20 min，并用水漂洗。充分顯影后的生物凝膠模板置于0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中10 min，使COOH基團(tuán)變成 COO－基團(tuán)，然后用0.5%Tween 20溶液清洗5次以達(dá)到中性pH值。

0.2 mol/L FeCl3溶液和1 mol/L AgNO3溶液是在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下制備的。將金屬鹽溶液滴加到生物凝膠模板上，約30 min，使金屬離子和COO－基團(tuán)充分螯合。隨后用氨水調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值，并用0.5%Tween 20溶液清洗5次。

2.5 實(shí)驗(yàn)表征

本實(shí)驗(yàn)使用場(chǎng)冷發(fā)射掃描電子顯微鏡JSM 7500(JEOL，Tokyo，Japan)進(jìn)行微結(jié)構(gòu)的形貌表征。加速電壓為 5.0 keV，濺射金層厚度為10 nm，工作模式 SEM，WD 8 mm。能譜儀 EDS(JSM 7001F能量色散X射線分析)表征金屬納米粒子。光學(xué)顯微鏡型號(hào)為Motic BA400。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶液組分對(duì)生物凝膠模板的影響

為了保證聚合物微結(jié)構(gòu)的生物相容性，選擇生物相容性極好的聚乙二醇二丙烯酸酯作為主體材料，吸收峰在紫外光區(qū)的亞甲基藍(lán)作為光敏劑，同時(shí)通過加入丙烯酸在聚合物微結(jié)構(gòu)中引入COOH基團(tuán)，而COOH基團(tuán)的引入導(dǎo)致溶液激光加工性能變差。聚丙烯酸是強(qiáng)吸水材料，在自由基聚合時(shí)會(huì)強(qiáng)烈吸水而導(dǎo)致單點(diǎn)曝光形成的像素點(diǎn)膨脹變形，從而不能得到程序設(shè)定的結(jié)構(gòu)。因此，需要減少丙烯酸在溶液中的比重。在本工作中通過先用只含有聚乙二醇二丙烯酸酯的溶液進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，在最優(yōu)的配比條件下，固定預(yù)聚物的含量，然后逐漸增加丙烯酸組分比例的辦法，使得結(jié)構(gòu)在形貌可以接受的情況下，得到最多的COOH基團(tuán)(即溶液組分中丙烯酸含量最大值)。

圖2是溶液組分優(yōu)化后的生物凝膠模板，此時(shí)聚乙二醇二丙烯酸酯為62.5%，丙烯酸為12.5%，亞甲基藍(lán)為0.075%。生物凝膠模板的結(jié)構(gòu)完整性和精細(xì)程度都較好，而COOH基團(tuán)的含量也足夠多。

圖2 復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生物凝膠模板Fig.2 Complex structure of biological gel template

3.2 激光參數(shù)對(duì)生物凝膠模板的影響

生物凝膠模板的制作是采用飛秒激光直寫的方式，通過單點(diǎn)曝光形成單個(gè)像素點(diǎn)疊加成所設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)［18］。因此，影響單個(gè)像素點(diǎn)的激光條件參數(shù)將直接影響生物凝膠模板的表面形貌和結(jié)構(gòu)完整程度。高的激光功率和長的單點(diǎn)曝光時(shí)間都使單個(gè)像素點(diǎn)充分曝光，有利于形成致密的結(jié)構(gòu)，然而它們卻存在不同，盡管長的單點(diǎn)曝光時(shí)間加工的效果更好，但將會(huì)導(dǎo)致整個(gè)加工過程耗時(shí)量增加，不利于快速制備結(jié)構(gòu)。大的激光功率往往因?yàn)槌^加工閾值而使熱效應(yīng)顯著，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變差甚至失效。因此，通過固定單一變量法，來優(yōu)化加工參數(shù)“窗口”，對(duì)應(yīng)點(diǎn)間距為100 nm的結(jié)構(gòu)，單點(diǎn)曝光時(shí)間最優(yōu)參數(shù)在100～400 μs之間，激光功率在16～28 mW之間。

3.3 Fe納米粒子的原位合成

圖3 生物凝膠模板進(jìn)行鐵納米粒子原位合成前后的能譜儀表征((a)～(f))分別為未進(jìn)行原位合成時(shí)電鏡照片及C、O、Si、Fe的分布情況((g)～(i))分別為原位合成后電鏡照片及 C、O、Si、Fe的分布情況Fig.3 EDS characterization before and after the iron nanoparticles in-situ synthesis in the bio-gel template((a)～ (f))，the SEM image and the distribution of the elements of C，O，Si and Fe before in-situ synthesis((g)～(i))The SEM image and the distribution of the elements of C，O，Si and Fe after in-situ synthesis

圖3是飛秒激光直寫后的方塊形生物凝膠模板對(duì)Fe納米粒子的原位合成。圖3(a)～3(f)是未經(jīng)過原位合成的生物凝膠模板的能譜儀表征。圖3(a)為SEM圖像，可以看到未經(jīng)過原位合成的生物凝膠模板表面光滑平整，內(nèi)部插圖為不同顏色分別代表C、O、Si、Fe等元素。圖3(b)整體顏色分布圖，圖3(c)為C元素分布，由于生物凝膠為有機(jī)物，因此有C元素呈明顯的方形分布。而圖3(d)為O元素分布，由于凝膠模板加工在蓋玻片上，蓋玻片主要成分為SiO2，因此O元素在這個(gè)圖中都有分布，而生物凝膠模板中有聚乙二醇二丙烯酸酯，其中也含有O元素，故圖中O元素在方塊微結(jié)構(gòu)的區(qū)域含量大于背景區(qū)域含量，綠顏色較深。而對(duì)于Si元素，則只存在于蓋玻片上，平均分布于圖3(e)中。圖3(f)為Fe元素的表征，可以看出由于蓋玻片和結(jié)構(gòu)中均不含F(xiàn)e元素，因此，圖中只有部分噪點(diǎn)，而無明顯的Fe元素分布現(xiàn)象。

圖3(g)～3(i)是經(jīng)過Fe納米粒子原位合成后的表征。由圖3(g)可以看出在經(jīng)過Fe納米粒子原位合成后，生物凝膠模板表面變的粗糙，而從圖3(h)～(k)可以看出，微結(jié)構(gòu)中的Fe納米粒子對(duì)能譜儀的X射線有很強(qiáng)的散射作用，從而出現(xiàn)明顯的陰影區(qū)域。圖3(i)則直接證明結(jié)構(gòu)中Fe元素集中分布在生物凝膠模板中。

圖4 多次原位合成納米粒子后生物凝膠模板的圖片F(xiàn)ig.4 Image of the bio-gel template after in situ synthesis

如圖4所示，原位合成納米粒子的步驟可以重復(fù)多次，從而使納米粒子粒徑增大。圖4(a)為多次原位合成Fe納米粒子后的生物凝膠模板的光學(xué)顯微鏡圖片，可以看出經(jīng)過多次原位合成后，鐵納米粒子含量和粒徑均有增加，表現(xiàn)在生物凝膠模板呈現(xiàn)出3價(jià)鐵的黃色。而多次原位合成后，3價(jià)鐵并不是均勻分布的，主要集中在中心區(qū)域，如圖4(b)，中心區(qū)域由于Fe納米粒子粒徑大，含量多，導(dǎo)致對(duì)電子束散射大，從而呈現(xiàn)出陰影區(qū)域。同時(shí)采用點(diǎn)掃描方式對(duì)其中的1，2，3點(diǎn)進(jìn)行Fe分布的相對(duì)強(qiáng)度的表征，如圖4(c)所示，可以看出2點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的區(qū)域Fe分布強(qiáng)度更大。分析其原因，可能是多次原位合成后產(chǎn)生的晶核的電荷吸引作用導(dǎo)致的。

3.4 Ag納米粒子的原位合成

如圖5所示，制作了兩層卷曲狀的三維生物凝膠模板并進(jìn)行Ag納米粒子的原位合成。圖5(a)中可以看出，對(duì)于制作復(fù)雜的層狀生物凝膠模板，飛秒激光直寫具有其他方法所不可比擬的優(yōu)勢(shì)［16］，可以實(shí)現(xiàn)這種三維復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的制作，并且在加工過程中只需要設(shè)計(jì)特定圖案的程序，無須制作昂貴、耗時(shí)的掩膜版，能夠?qū)崿F(xiàn)生物凝膠模板制作過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。因此，采用飛秒激光能夠快速制備生物材料光子晶體、細(xì)胞微鑷、納米針、細(xì)胞原位支架及各向異性顆粒等，從而使聚合物微結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有更大的應(yīng)用潛力。此外，由于加工預(yù)聚物溶液中COOH基團(tuán)的引入，使得生物凝膠模板可以與多種金屬陽離子耦合，從而形成多種納米粒子修飾的結(jié)構(gòu)，并且在多次的原位合成步驟后，金屬納米粒子的粒徑和含量也可以得到控制。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于功能組分丙烯酸的引入，使得凝膠模板在氫氧化鈉處理過程中羧酸基團(tuán)互相排斥從而使整個(gè)生物凝膠模板結(jié)構(gòu)膨脹度變大，有利于金屬鹽溶液的進(jìn)入成核，以及納米粒子核的長大。羧酸基團(tuán)使金屬陽離子在特定區(qū)域進(jìn)行選擇性吸附。由于凝膠結(jié)構(gòu)浸泡在鹽溶液中呈現(xiàn)負(fù)價(jià)態(tài)，使金屬陽離子的吸附能力進(jìn)一步增強(qiáng)。比較圖5(c)和圖5(f)可以看出在經(jīng)過多次納米粒子原位合成后，生物凝膠模板中銀的含量相對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)數(shù)來說是非常高的，區(qū)域中Ag的含量達(dá)到了9%，比C含量7%還多。同時(shí)，從圖5(f)中可以看出，雙層卷曲結(jié)構(gòu)的上層，由于結(jié)構(gòu)懸空，相對(duì)擴(kuò)散距離比束縛在襯底上的下層更小，金屬鹽溶液浸泡時(shí)，更有利于金屬納米粒子的成核與生長，因此，上層結(jié)構(gòu)銀納米粒子更多，表觀黃色程度更深。圖6為圖5中上層卷曲結(jié)構(gòu)的Ag分布，可以看出Ag M相和Ag Lα相相對(duì)強(qiáng)度最大。

圖5 三維結(jié)構(gòu)的生物凝膠模板原位合成銀納米粒子的能譜儀表征((a)～(f))分別為電鏡照片，總體元素分布及 C、O、Si、Ag的分布情況Fig.5 EDS characterization after the silver nanoparticles in situ synthesis in the 3D bio-gel template.The SEM image，the total distribution of all elements and the distribution of the single element of C，O，Si and Ag

圖6 上層卷曲結(jié)構(gòu)的Ag分布Fig.6 Silver distribution in the upper curl layer of the bio gel template

4 結(jié)論

本文將先進(jìn)的飛秒激光直寫技術(shù)與納米粒子原位合成方法相結(jié)合，先由飛秒激光直寫出生物凝膠模板，然后用金屬鹽溶液處理凝膠模板原位合成納米粒子，制備出同時(shí)具有三維復(fù)雜形貌及特定納米粒子化學(xué)修飾的聚合物微結(jié)構(gòu)。在生物凝膠模板的制作過程中，通過調(diào)節(jié)溶液組分和激光加工參數(shù)，實(shí)現(xiàn)在保證微結(jié)構(gòu)的復(fù)雜精細(xì)程度前提下(分辨率為亞100 nm，結(jié)構(gòu)大小為10 μm量級(jí))，更多地保留功能結(jié)合位點(diǎn)COOH基團(tuán)。此外，進(jìn)行了方塊微結(jié)構(gòu)Fe納米粒子和Ag納米粒子的原位合成，以及復(fù)雜的雙層卷曲結(jié)構(gòu)的Ag納米粒子原位合成。多次循環(huán)原位合成納米粒子步驟后，對(duì)納米粒子聚集行為進(jìn)行了分析。這種簡單高效的功能性聚合物微結(jié)構(gòu)加工方法，在光子學(xué)［1］、生物醫(yī)學(xué)工程［4］、催化［19］、組織工程［3］及數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景［21-24］。

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